Вопрос 23.

Цитопагенное действие (ЦПД) или цитопатический эффект (ЦПЭ) и гемадсорбция.

Обнаружить вирус в клетках можно по цитопатическому действию или цитопатическому эффекту.

ЦПД – это любые изменения клеток под влиянием размножающегося в них вируса. Проявляются в виде многообразных функциональных, биохимических и структурных изменений. Функциональные и биохимические изменения в клетке возникают вскоре после инфицирования клетки вирусом. Они заключаются в угнетении процессов деления клеток, синтеза клеточных нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) и белков, а на более поздних стадиях инфекционных процесса — в полном прекращении синтетических процессов (в клетке прекращается собственный метаболизм).

Для обнаружения ЦПД зараженные культуры клеток просматривают под малым увеличением светового микроскопа.

Наиболее существенно различаются три формы ЦПД:

1. Фрагментация. Разрушение клеток на отдельные фрагменты (вирус везикулярного стоматита).

2. Округление. Клетки принимают шаровидную форму и отделяются от стекла (аденовирусы).

3. Симпластообразование. Образование гигантских клеток: цитоплазма соседних клеток сливается вследствие растворения клеточных оболочек и образуется одна большая клетка со многими ядрами (вирус чумы КРС).

Гемадсорбция – адсорбция эритроцитов на поверхности пораженных вирусом клеток.

Используется только для индикации вирусов, содержащих гемагглютинины.

В пробирки с зараженным вирусом культурой ткани вносят 0,2 мл 0,4%-ной взвеси эритроцитов. Пробирки встряхивают и оставляют в наклонном положении. Длительность контакта эритроцитов с клетками зависит от температуры инкубации и вида вируса. Учет реакции производят под малым увеличением микроскопа после непродолжительного покачивания пробирки для отделения неадсорбированных эритроцитов от поверхности клеток. При вирусной гемадсорбции эритроциты прочно фиксированы на клетках и сохраняются на них после 1-2 кратного отмывания. Адсорбируясь на поверхности пораженных вирусом клеток, эритроциты образуют характерные скопления.

Вопрос 24.

Принципы люминисцентной вирусоскопии и методы иммунофлуоресценции.

Вирусоскопия люминесцентная - метод выявления вирусов или вирусоспецифических антигенов с помощью люминесцирующих антисывороток.

Сущность явления люминесценции – при поглощении различных видов энергии молекулами некоторых веществ их атомы переходят в возбужденное состояние, а затем, возвращаясь в исходное состояние, выделяют поглощенную энергию в виде светового излучения.

Многие микроорганизмы обладают собственной флуоресценцией (первичной), однако ее интенсивность мала. Поэтому используются флуорохромы - специальные вещества, которые могут поглощать свет и являются люминесцентными (вторичная флуоресценция). Отечественная промышленность выпускает более 30 различных флуорохромов-люминесцентных красок (люминофоров), но не все они пригодны для мечения антител. В России наиболее часто применяются изоционат флуоресцеина или изотиоционат флуоресцеина, дающий зеленую флуоресценцию, изоционат родамина В или изотиоционат родамина В - оранжевая флуоресценция, и некоторые другие красители. Реже применяют алфадиметилесульфохлорид, дающий слабое желтое свечение.

Люминесцентный микроскоп оснащен специальной осветительной системой, которая излучает свет, вызывающий соответствующее свечение объектов.

Провоцировать подобное свечение объектов рекомендуется либо ультрафиолетом, либо сине-фиолетовыми лучами. Таким образом можно получить цветное изображение.

При помощи данной технологии меченные флуорохромами антитела идентифицируют антигены чужеродных организмов.

Иммунофлуоресценция.

Прямая иммунофлуоресценция – обнаружение вирусных антигенов в интересующем образце окрашиванием со специфическим меченым флуоресцином антивирусным антителом.

Срез замороженной ткани, клеточный мазок или клеточный монослой на покровном стекле обычно фиксируется метанолом или ацетоном и заливается флуоресцином, конъюгированным с противовирусным антителом. Затем несвязанные антитела отмывают. Клетки исследуют при помощи световой микроскопии, используя мощный источник ультрафиолетового света. Зеленый свет, выделяемый образцом, обнаруживается при помощи встроенного в окуляры фильтра, который поглощает весь случайный ультрафиолетовый и голубой свет.

Непрямая иммунофлуоресценция- противовирусные антитела являются не мечеными. Они связаны с антигеном и их распознают при помощи конъюгированного с флуоресцином антииммуноглобулина. Респираторные инфекции, вызванные парамиксовирусами, ортомиксовирусами, аденовирусами и герпесвирусами, определяются благодаря быстрой диагностики при помощи иммунофлуоресценции.

Также этот метод может применяться в отношении тканей, например, при биопсии для диагностики герпесвирусных заболеваний или при аутопсии для подтверждения бешенства животного, умерщвленного после укуса человека.