- •Вопрос 1.
- •Вопрос 2.
- •Вопрос 3.
- •Вопрос 4.
- •Вопрос 5.
- •Вопрос 6.
- •Вопрос 7.
- •Вопрос 8.
- •Вопрос 9.
- •Вопрос 10.
- •Вопрос 11.
- •Вопрос 12
- •Вопрос 13.
- •Вопрос 14.
- •Вопрос 15.
- •Вопрос 17.
- •Вопрос 18.
- •Вопрос 19.
- •Вопрос 20.
- •Вопрос 21.
- •1. Культивирование на естественно-восприимчивых и лабораторных животных.
- •2. Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах.
- •3. Культивирование вирусов на культурах тканей и клеток (см вопрос 22)
- •Вопрос 22.
- •Вопрос 23.
- •Вопрос 24.
- •Вопрос 25.
- •Вопрос 26.
- •Вопрос 27.
- •Вопрос 28.
- •Вопрос 29.
- •Вопрос 30.
- •Вопрос 31.
- •Вопрос 32.
- •Вопрос 33.
- •Вопрос 34.
- •Вопрос 35.
- •Вопрос 36
- •Вопрос 37.
- •Вопрос 38.
- •Вопрос 39.
- •Вопрос 40.
- •Вопрос 41.
- •Вопрос 42.
- •Вопрос 43.
- •Вопрос 44.
- •Вопрос 45.
- •Вопрос 46.
- •Вопрос 47.
- •Вопрос 48.
- •Вопрос 49
- •Вопрос 51
- •Вопрос 52
- •Вопрос 53.
- •Вопрос 54.
- •Вопрос 55.
- •Вопрос 56.
- •Вопрос 57
- •Вопрос 58
- •Вопрос 59
- •Вопрос 60
Вопрос 13.
Приготовление рабочей суспензии из патматериала, методы очистки вируса.
В лаборатории патматериал, его принято считать первичным, разделяют: одну часть полученного патматериала замораживают и хранят до окончания экспертизы для дополнительных исследований, из второй части готовят вирус-содержащую суспензию по следующей методике:
1. Приготовление вируссодержащей суспензии из органов и тканей:
- ткани измельчают и перетирают в фарфоровой ступке;
- готовят 10% суспензию на фосфатном буфере или растворе Хенкса;
- центрифугируют при 1500-3000 об/мин в течение 15-20 минут, надосадочную жидкость отбирают и освобождают от контаминантов антибиотиками широкого спектра действия (пенициллин, стрептомицин, нистатин, цефазолин, гентамицин);
- материал подвергают бактериологическому контролю путём посева на МПА, МПБ, МППБ, среду Сабуро;
- при отрицательном результате бактериологического контроля проводят исследование вируссодержащей суспензии; в случае положительного бактериологического контроля суспензию дополнительно обрабатывают антибиотиками и повторно ставят контроль.
Суспензию хранят при температуре минус 20-70°С.
2. Приготовление вируссодержащей суспензии из смывов, соскобов:
- тампон отполаскивают в транспортной среде, отжимают;
- центрифугируют 1500-3000 об/мин в течение 15-20 минут, надосадочную жидкость отбирают и освобождают от контаминантов антибиотиками широкого спектра действия;
- материал подвергают бактериологическому контролю путём посева на МПА, МПБ, МППБ, среду Сабуро;
- из осадка делают мазок для постановки РИФ.
3. Приготовление вируссодержащей суспензии из фекалий:
- фекалии гомогенизируют в фосфатно-буферном растворе;
- центрифугируют 1500-3000 об/мин в течение 15-20 минут, надосадочную жидкость отбирают и освобождают от контаминантов антибиотиками широкого спектра действия;
- материал подвергают бактериологическому контролю путём посева на МПА, МПБ, МППБ, среду Сабуро.
4. Приготовление вируссодержащей суспензии из кожных поражений.
- стенки папул, корочки растирают с фосфатно-буферным раствором;
- центрифугируют 1500-3000 об/мин в течение 15-20 минут, надосадочную жидкость отбирают и освобождают от контаминантов антибиотиками широкого спектра действия;
- материал подвергают бактериологическому контролю путём посева на МПА, МПБ, МППБ, среду Сабуро.
Вопрос 14.
Методы концентрации вирусов.
Методы концентрации вирусов в рабочей суспензии.
При многих вирусных инфекциях наблюдается феномен посмертной аутостерилизации. В таком случае вирус настолько мал, что выделить его не удается, поэтому применяют концентрацию вируса, используют 3 метода:
метод дифференциального центрифугирования;
метод фильтрации рабочей суспензии через коллоидные фильтры;
адсорбционный метод.
Метод дифференциального центрифугирования:
Метод основан на том, что вирусные частицы в жидкости значительно легче суспензируются, чем обрывки тканей или микроорганизмов. Метод заключается в следующем:
10% рабочую суспензию разливают в стерильные центрифужные пробирки и центрифугируют при 2,5 - 3 тыс. об/мин в течение 10-15 мин. (оседают твердые частицы и тканевые элементы);
берется 2/3 надосадочной жидкости, центрифугируется при 6,0 – 8,0 тыс. об/мин - 15-20 мин. (оседают микроорганизмы);
берется 2/3 надосадочной жидкости, центрифугируется 20–25 тыс. об/мин - 20-25 мин. (оседают вирусы).
осторожно удаляют 2/3 надосадочной жидкости, встряхивают, вирус суспензируется и его концентрация в 2-3 раза будет выше, чем в первоначально приготовленной рабочей суспензии, и он будет очищен от тканевых элементов и микроорганизмов.
Метод фильтрации рабочей суспензии через коллоидные фильтры:
Поры коллоидных фильтров пропускают только воду, но не пропускают микробы и вирусы. При фильтрации 10% рабочей суспензии вирусы адсорбируются на поверхности фильтра, микробы нет. Фильтр промывают фосфатно-буферным раствором. При этом удаляются крупные тканевые частицы и значительная часть микрофлоры. Фильтр измельчают и помещают в меньший объемом стерильного фосфатного буфера. Центрифугируют 10-15 минут при 8000 об/мин. При этом в осадок уйдут частицы коллоидного фильтра, бактериальная микрофлора. А в надосадочной жидкости останется вирус, и его концентрация будет больше, чем в исходном растворе.
Адсорбционный метод (по Соколову):
Метод основан на способности вирусов адсорбироваться на поверхности эритроцитов. Спектр адсорбционной способности вируса широк – частицы глины, гипса, угля, гидроокись алюминия и др., что находит применение в вирусологической практике.
Сущность метода: берется 20 мл вируссодержащей жидкости, добавляется 1%-ая взвесь отмытых эритроцитов кур или других животных (1% к объему жидкости). Смесь встряхивают, помещают в холодильник при температуре +40℃...+50℃ на 2-3 часа. При этом вирус адсорбируется на эритроцитах. Смесь центрифугируют при 1,5 - 2,5 тыс. об/мин - 5-10 минут, в результате чего в осадок выпадают эритроциты вместе с адсорбированным вирусом. Надосадочную жидкость сливают, добавляют к осадку 2 мл физиологического раствора, осадок встряхивают, помещают в термостат при температуре 370℃ на 2 часа, где происходит элюция (сползание) вируса с эритроцитов. Суспензию центрифугируют при 1,5 - 2,0 тыс. об/мин - 5-10 минут. В осадок выпадают эритроциты, а в надосадочной жидкости находится вирус концентрация которого в 10 раз больше, чем в исходном вируссодержащем материале.