- •ПРЕДИСЛОВИЕ ПЕРЕВОДЧИКА
- •ПРЕДИСЛОВИЕ
- •СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
- •1. Введение
- •1.1. Освещение по Кёлеру
- •1.1.1. Принципы метода
- •1.1.2. Предварительная проверка оборудования
- •1.2. Установка света по Кёлеру
- •2.1. Преломление
- •2.1.1. Числовая апертура
- •2.2. Отражение, поглощение и пропускание
- •2.3. Флуоресценция/фосфоресценция
- •2.4. Поляризация
- •2.5. Дифракция
- •2.5.1. Тестовые пластинки Аббе
- •2.5.2. Формирование первичного изображения
- •2.5.3. Разрешающая способность
- •2.5.4. Роль конденсора в разрешении микроскопа
- •2.5.5. Увеличение
- •2.5.6. Увеличение и разрешение
- •4. Поле зрения
- •5. Резюме
- •6. Литература для дальнейшего чтения
- •1. Введение
- •1.1. Определение контраста
- •2. Светлопольная микроскопия
- •3. Фазовый контраст
- •3.2. Дифрагированный свет в фазовом контрасте
- •4. Темнопольная микроскопия
- •4.1. Освещение по Рейнбергу
- •4.2. Темнопольные конденсоры высокого разрешения
- •4.3. Темнопольное изображение
- •5. Поляризованный свет
- •5.1. Использование одиночного поляризатора
- •5.2. Использование скрещенных поляризаторов
- •5.2.2. Направление двулучепреломления
- •6.3. Интерференционная отражательная микроскопия
- •6.3.2. Физические основы метода
- •6.3.3. Интерпретация результатов
- •7.1. Красители
- •7.2. Использование светофильтров
- •7.3. Срезы
- •7.4. Качество препарата
- •8. Другие методы
- •8.1. Дисперсионное окрашивание
- •10. Благодарности
- •11. Литература
- •ФИКСИРОВАНИЕ ИЗОБРАЖЕНИЯ
- •1. Введение
- •2. Рисование
- •3. Фотомикрография
- •4.1. Разрешение
- •4.2. Разрешающая способность и размер отпечатка
- •4.4. Освещение
- •5. Микроскоп для фотомикрографии
- •5.1. Штатив микроскопа
- •5.2. Оптика
- •5.2.1. Числовая апертура и увеличение объективов
- •5.2.2. Исправление аберраций
- •5.2.4. Иммерсионные объективы
- •5.2.5. Глубина резкости
- •5.2.6. Кривизна поля зрения
- •5.2.7. Типы конденсоров
- •5.2.8. Чистка линз
- •6. Камера для фотомикрографии
- •6.1. Выбор размера пленки
- •6.3. Специальная фотомикрографическая камера
- •6.4. Микроскопы со встроенными фотосистемами
- •6.5. Камера с мехами
- •7. Наведение на фокус и определение экспозиции
- •7.1. Наведение на фокус
- •7.2. Определение экспозиции
- •7.3. Контроль экспозиции
- •8. Выбор условий для фотомикрографии
- •8.1. Фотографический процесс
- •8.1.1. Чувствительность пленки
- •8.1.2. Зернистость
- •8.1.3. Контрастность
- •8.2. Черно-белая фотомикрография
- •8.3. Цветная фотомикрография
- •8.3.1. Цветные отпечатки или слайды
- •8.3.2. Печать со слайдов
- •8.3.3. Цветовая температура
- •8.3.4. Коррекция цветовых искажений
- •8.3.6. Выбор чувствительности пленки
- •8.4. Поляроидные клетки
- •8.4.2. Камера Поляроид SX70
- •8.4.3. Поляроидные слайды
- •8.5. Хранение неэкспонированной пленки
- •9. Фотомакрография
- •9.1.1. Стереомикроскопы для фотомикрографии
- •9.1.2. Макроскопы
- •9.1.3. Фотомакрографические объективы
- •9.2. Освещение для фотомакрографии
- •9.3. Определение экспозиции при фотомакрографии
- •10. Завершение процесса фотомикрографии
- •10.1. Содержание записей
- •10.2. Хранение негативов
- •10.3. Хранение слайдов
- •10.4. Монтаж слайдов
- •10.5. Хранение отпечатков
- •10.6. Определение и указание увеличения
- •11. Практическое руководство
- •11.2. Начальная калибровка экспонометра
- •12. Литература для дальнейшего чтения
- •ИММУНОГИСТОХИМИЯ
- •1. Введение
- •2. Антитела
- •2.1. Структура иммуноглобулинов
- •2.2. Поликлональная антисыворотка
- •2.3. Моноклональные антитела
- •2.4. Очистка антител
- •2.5. Специфичность реакций антител
- •2.6. Хранение антител
- •3.1. Выбор условий обработки ткани
- •3.2. Выявление скрытых антигенов
- •4. Выбор способа мечения
- •4.1. Флуоресцентные метки
- •4.2. Ферментные метки
- •4.2.1. Пероксидаза хрена
- •4.2.2. Щелочная фосфатаза
- •4.2.3. Глюкозооксидаза
- •4.2.4. Галактозидаза
- •4.3. Коллоидное золото
- •4.4. Выбор метки
- •5. Методы окраски
- •5.1. Прямой метод
- •5.2. Непрямой метод
- •5.4. Системы с использованием биотин — авидина
- •5.5. Другие методы
- •6. Экспериментальные методы
- •6.1. Общее описание метода
- •6.2. Выбор правильного разведения антител
- •6.3. Флуоресцентные метки
- •6.4. Пероксидаза
- •6.4.1. Ингибирование эндогенного фермента
- •6.5. Щелочная фосфатаза
- •6.5.1. Блокирование эндогенного фермента
- •6.5.2. Мера предосторожности
- •6.6. Глюкозооксидаза
- •6.7. Галактозидаза
- •6.9. Некоторые общие процедуры
- •6.9.1. Покрытие предметных стекол
- •6.9.2. Дополнительное окрашивание
- •7.1. Контрольные препараты
- •7.2. Решение проблем
- •9. ДНК-зонды для гибридизации in situ
- •9.1. Принцип метода гибридизации
- •9.2. Экспериментальная процедура
- •9.2.1. Выявление Y-хромосомы
- •9.2.2. Выявление цитомегаловируса
- •10. Цитологические препараты
- •11. Количественная оценка
- •12. Оборудование
- •13. Благодарности
- •14. Литература
- •ГИСТОХИМИЯ И СВЕТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ
- •1. Введение
- •1.1. Объекты для гистохимического окрашивания
- •1.1.1. Что такое окрашивание?
- •2. Приготовление и хранение срезов препаратов
- •2.1. Необходимые характеристики препарата
- •2.2. Методы приготовления и хранения препаратов
- •2.2.1. Получение тонких слоев
- •3. Что можно выявлять? Некоторые примеры
- •3.1. Выявление химических свойств
- •3.1.1. Химические фрагменты
- •3.1.2. Специфические вещества
- •3.1.3. Классы веществ
- •3.2. Выявление биологических объектов
- •3.2.1. Биологические объекты
- •3.2.2. Биологические процессы
- •3.3. Морфологические исследования
- •4. Выбор методов
- •5.1. Оценка селективности методов
- •5.2. Оценка локализации окрашивания
- •5.4. Оценка чистоты реагентов
- •5.5. Номенклатура реагентов
- •6. Что необходимо для гистохимической работы
- •6.1. Оборудование и материалы
- •6.2. Как научиться работать?
- •7. Почему используются гистохимические методы
- •8. Благодарности
- •ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ
- •1. Введение
- •2. Флуорохромы
- •3. Флуоресцентный микроскоп
- •3.1. Способы освещения
- •3.1.1. Освещение проходящим светом
- •3.1.2. Освещение падающим светом
- •3.2. Источники света
- •3.3. Домики для ламп
- •3.4. Фильтры
- •3.4.1. Возбуждающие фильтры
- •3.4.2. Запирающие фильтры
- •3.4.3. Цветные светоделительные зеркала
- •3.5. Объективы и окуляры
- •4. Применение флуоресцентных красителей
- •4.1. Нуклеиновые кислоты
- •4.1.1. Прижизненное окрашивание флуорохромами
- •4.2. Иммунофлуоресценция
- •4.3. Флуоресценция нейромедиаторов
- •4.4. Двойное окрашивание
- •5. Микрофлуориметрия
- •5.1. Введение
- •5.2. Стандарты флуоресценции
- •5.3. Оборудование
- •5.3.1. Инвертированные микрофлуориметры
- •5.3.2. Сканирующие микрофлуориметры
- •5.4. Измерения содержания ДНК
- •5.4.1. Оборудование
- •5.4.2. Подготовка материала
- •5.4.3. Процедура окрашивания
- •5.4.4. Проведение измерений
- •6. Анализ изображения при флуоресценции
- •7. Сканирующая лазерная микроскопия
- •8. Литература
- •МИКРОМЕТРИЯ И АНАЛИЗ ИЗОБРАЖЕНИЯ
- •1. Введение
- •2. Простая микрометрия
- •2.1. Измерения длины
- •2.1.3. Окуляр-микрометр сдвига
- •2.1.4. Другие методы измерения длины
- •2.2 Измерения углов
- •2.3. Измерение толщины
- •2.4. Счетные камеры
- •2.4.2. Техника работы с гемоцитометром
- •3.1.1. Определение АA в двухфазном препарате
- •3.2. Принципы измерения площади поверхности
- •4. Измерения с использованием дигитайзера
- •5.2. Измерения с помощью компьютера
- •6. Приборы и математическое обеспечение работ
- •7. Литература
- •ВИДЕОМИКРОСКОПИЯ
- •1. Видеомикроскопия и оборудование для нее
- •1.1. Введение
- •1.1.1. Видеоусиление
- •1.1.2. Видеоинтенсификация
- •1.1.3. Цифровая обработка изображения
- •1.2.1. Условия ограниченного числа фотонов
- •1.3. Различные методы видеомикроскопии
- •1.3.1. Видеомикроскопия с усилением
- •1.3.2. Аналоговое усиление контраста
- •1.3.3. Цифровая обработка изображения
- •1.4.1. Камеры и контроллеры камер
- •1.4.5. Видеопроцессорные платы
- •1.4.6. Монофункциональные процессоры
- •1.4.7. Взгляд в будущее
- •1.5. Условия, налагаемые на микроскоп
- •1.6. Как соединить телекамеру с микроскопом
- •2.1. Различные виды VEC-микроскопии
- •2.2. Приготовление препаратов
- •2.3. Получение изображения
- •2.4. Интерпретация изображений
- •2.5. Типичные применения и ограничения метода
- •2.5.1. Светлопольная микроскопия
- •2.5.2. Темнопольная микроскопия
- •2.5.4. Фазовый контраст
- •2.5.5. Поляризационная микроскопия
- •2.5.7. Отражательная контрастная микроскопия
- •2.5.8. Флуоресцентная микроскопия
- •2.5.9. Примеры применения в биологии и биохимии
- •3.1. Введение
- •3.2. Процесс формирования изображения
- •3.2.1. Условия, касающиеся микроскопа
- •3.2.2. Получение статических изображений
- •3.2.3. Получение изображений подвижных объектов
- •3.3. Типичные приложения
- •3.3.2. Картирование отношений
- •3.3.4. Визуализация молекул
- •3.3.6. Люминесценция
- •3.3.7. Нейробиология
- •4.1. Пространственные измерения
- •4.2. Измерения по интенсивности
- •5.1. Видеозапись и редактирование
- •5.1.1. Стандарты видеотехники
- •5.1.2. Форматы видеопленок
- •5.1.3. Качество видеопленок
- •5.1.4. Видеомагнитофоны
- •5.1.5. Видеомагнитофоны с цейтраферной записью
- •5.1.6. Запись при видеомикроскопии
- •5.1.8. Копирование и редактирование видеозаписей
- •5.2.1. Оборудование
- •5.3. Перенос видеозаписей в видеофильм
- •5.4. Рисование с монитора
- •6. Благодарности
- •7. Литература
- •1. Введение
- •2. Классификация сегментов хромосом
- •2.1. Гетерохроматиновые сегменты
- •2.2. Эухроматиновые сегменты
- •2.3. Ядрышковые организаторы
- •2.4. Кинетохоры
- •4.2. G-окрашивание
- •4.2.1. ASG-метод
- •4.2.3. Метод Галлимора и Ричардсона
- •4.3. R-окрашивание
- •4.4. Q-окрашивание
- •4.4.1. Q-окрашивание с помощью акрихина
- •4.5.2. Процедура окраски
- •5.1. Окрашивание ДАФИ/дистамицином
- •5.2.1. Метод культивирования клеток
- •5.2.2. Методика окраски
- •5.3.2. Синхронизация с помощью БУДР [39]
- •5.3.3. Синхронизация с помощью ФУДР [13, 40]
- •6. Наблюдение и регистрация сегментов хромосом
- •6.3. Фотографирование сегментированных хромосом
- •6.4.1. Получение профилей сегментов
- •6.4.2. Отражательная микроскопия
- •6.4.3. Измерение полиморфизма хромосом
- •7. Благодарности
- •8. Литература
- •9. Литература для дальнейшего чтения
как кладут фотобумагу при изготовлении отпечатков, или вкладывают в фотокамеру, из которой вынут объектив. В последнем случае можно воспользоваться экспонометром и затвором фотокамеры. Таким способом можно получить как негативы, так и слайды. Если лаборатория оборудована для печати с цветных слайдов, например системой проявления Cibachrom, то можно получать первоклассные результаты при прямом проецировании препаратов, таких, как биологические срезы, с помощью фотоувеличителя непосредственно на фотобумагу, используя при этом препараты как слайды.
9.2. Освещение для фотомакрографии
В фотомакрографии к освещению объектов предъявляются большие требования, и здесь можно дать лишь несколько кратких советов. Для твердых препаратов, фотографируемых в отраженном свете, могут быть использованы точечные источники, в которых свет передается от небольшого интенсивного источника через световоды, или лампа-вспышка. Следует внимательно следить за возможными эффектами от теней, возникающих в зависимости от положения источника и влияющих на вид объекта. Как правило, следует использовать несколько источников света, применяя один в качестве основного, а второй, менее мощный, — для устранения теней. Многие объекты лучше всего фотографировать при почти полном отсутствии теней, применяя для этого бестеневую палатку. Простейшую бестеневую палатку можно сделать вручную следующим образом. Возьмите тонкую белую бумагу или другой подходящий материал и сделайте из него обертку вокруг объекта, в несколько раз большую, чем его диаметр. Даже одиночный источник света, направленный через бумагу, даст при этом рассеянный и отраженный бестеневой свет. Световая палатка особенно удобна в применении к объектам с блестящими поверхностями, а также при работе с лампой-вспышкой, где избавиться от теней бывает 'непросто. Удобные световые палатки для мелких объектов можно сделать из половинок белых куриных яиц, шариков для пинг-понга, бумажных чашек и т. д.
Получение равномерного освещения в проходящем свете представляет в фотомакрографии особые трудности, и в идеале требуется специальное оборудование, такое как диаскопические осветители, изготавливаемые фирмами Leitz или Nikon для их фотокамер с раздвижными мехами. Они дают равномерно освещенное поле зрения, близкое по качеству к тому, которое получается в микроскопе при установке света по Кёлеру, но каждый раз при смене увеличения необходимо тщательно настраивать свет. Осветители проходящего света, смонтированные на штативах стереомикроскопов и макроскопов, дают удовлетворительное освещение в определенном диапазоне увеличений, и, как правило, ими можно пользоваться для фотомакрографии. В крайнем случае можно получить приемлемые результаты, если поместить препарат на чистое стекло, расположенное на некотором расстоянии от куска белой карточки, равномерно освещенного лампой накаливания или лампой-вспышкой.
9.3. Определение экспозиции при фотомакрографии
Определение экспозиции при фотомакрографии часто вызывает затруднения, поскольку существует большое разнообразие препаратов, условий освещения и систем для получения изображений. На практике наиболее удобны 35-миллиметровые фотокамеры с экспонометром, работающим через объектив. При использовании камер большого формата или поляроидных пленок экспозицию следует определять с помощью ступенчатой пробы (разд. 8.4.1) или применяя экспонометр, который устанавливается в плоскости пленки. Для получения изображений большого формата, в особенности при больших увеличениях, как правило, необходима продолжительная экспозиция, при этом следует помнить о возможности возникновения вибраций во время съемки и реципрокной ошибки.
Если при съемке на 35-миллиметровую пленку приходится использовать лампу-вспышку, то следует применять камеры типа Olympus OM2, ОМ4 и некоторые другие с установкой экспозиции вспышки «от пленки». В этих системах вспышка гасится тогда, когда на пленку попадает достаточно света, что позволяет получать правильно проэкспонированную пленку даже в сложных условиях фотомакрографии.
10. Завершение процесса фотомикрографии
10.1. Содержание записей
Хранение материалов начинается с того, что вы записываете на листке бумаги все детали, касающиеся отснятых на данной пленке кадров. В идеале таким листком должна снабжаться каждая пленка, и в нем должны быть ее серийный (заводской) номер, вероятно включающий в себя дату или год выпуска, имя оператора, тип пленки и способ ее проявления, а также следующая информация о каждом кадре (как минимум): экспозиция, препарат, использованные объектив и окуляр, фактор камеры или промежуточное увеличение, метод получения контраста в микроскопе, детали, касающиеся использования светофильтров, величина напряжения на лампе осветителя, установка чувствительности пленки и коррекция выдержки, как проводилось измерение экспозиции (в пятне или по полю), а также некоторые особые примечания, которые могут пригодиться в дальнейшем.
66
10.2. Хранение негативов
Негативы следует хранить в специальной упаковке защищенными от пыли, влаги, тепла, возможного повреждения абразивами и нечаянного прикосновения пальцев; цветные негативы следует хранить в темноте, чтобы предохранить от выцветания. Пожалуй, наиболее удобной системой для хранения является папка из вкладных листков, каждый размером 26X31 см. В каждый листок укладываются семь полосок 35миллиметровой пленки по 6 кадров каждая. Эти листки могут быть из светлого или полностью прозрачного материала, последний более предпочтителен, так как позволяет просматривать кадры, не вынимая пленок. Листки с записями, сделанными во время съемки, можно укладывать вместе с негативами и листом контактных отпечатков. Можно приобрести также папки для хранения свернутых негативных пленок, упаковки для одиночных 6-кадровых полосок 35-миллиметровой пленки и для плоских пленок различного формата.
10.3. Хранение слайдов
Слайды следует хранить в тех же условиях, что и негативы, и кроме того, в темноте (разд. 10.2). Они могут быть уже вставлены в рамки лабораторией-проявителем. Несмонтированные полоски пленки следует хранить так же, как негативы, до тех пор пока они не смонтированы для просмотров. Слайды в рамках, как правило, размером 50x50 мм, могут храниться в коробках, в которых их получают после проявления, а также в специальных коробках с ячейками, в специальных прозрачных подвесках, в папках или в магазинах, которые могут быть прямо вставлены в диапроектор. Если позволяют средства, можно приобрести систему «Slidex» с полужесткими прозрачными листками, которые можно непосредственно использовать в специальном проекторе. Она представляет собой удобную систему для хранения и показа слайдов.
Нельзя предложить какой-либо идеальной системы, по которой должен быть устроен архив слайдов. Все зависит от того, как они используются. Слайды можно хранить в хронологической последовательности, с каждой пленки вместе, пронумеровав и пометив их так, чтобы было понятно, какие записи к ним относятся. Можно, наоборот, сгруппировать слайды по темам или применительно к конкретным лекциям. Проблемы возникают, когда слайд необходимо использовать более чем в одной лекции. Здесь вас могут выручить дубликаты, получаемые либо с помощью копирования, либо путем многократной съемки одного и того же кадра на микроскопе. В дополнение к другой информации каждый слайд должен иметь свой уникальный номер, который позволит вам поместить его на то же место в архив после использования. Эти советы легко давать, но гораздо труднее выполнять, однако следование им избавит вас от многих неприятностей и сэкономит время, уходящее на поиски пропущенного слайда.
10.4. Монтаж слайдов
Для демонстрации через проектор 35-миллиметровые слайды обычно монтируются в рамки размером 50x50 мм. В настоящее время выпускается много типов рамок с защитными стеклами и без них. Рамки без стекол дешевы, ими легко пользоваться, и они не дают интерференции с изображениями от четырех поверхностей двух покровных стекол, каждое из которых загрязнено. Вместе с тем они не защищают слайд от загрязнений и царапин, но вполне пригодны для слайдов, которые хранятся в магазинах и редко берутся в руки. Покровные стекла, помимо защиты от повреждений, сохраняют пленку плоской в проекторе. Поскольку навести фокус на всю поверхность искривленного слайда бывает очень трудно, фирма Leitz (Leica) разработала для своих проекторов специальную линзу с искривленным полем специально для показа невыправленных слайдов.
Слайды, смонтированные с использованием покровных стекол, также создают свои проблемы. Опыт показывает, что стекла часто поставляются грязными, так что их необходимо тщательно мыть. Кроме того, с годами на их внутренней поверхности и на пленке накапливается пыль. Чаще, однако, пленка прилипает к стеклу, как правило со стороны эмульсии, в особенности после показа через проекторы с охлаждением. Это приводит к появлению радужных интерференционных колец Ньютона из-за тесного контакта эмульсии и стекла и может создать неудобства. Чтобы избежать этого, применяются специальные стекла со слегка неровной поверхностью.
После установки в рамки слайды необходимо пометить так, чтобы их можно было правильно устанавливать в проектор. Помните, что для этого есть семь неправильных положений и только одно правильное! Обычно слайды маркируют, делая на них цветную точку чернилами или из клейкой бумаги так, чтобы слайд был правильно виден, если метка, расположенная в левом нижнем углу слайда, находится на обращенной к вам стороне. Когда слайд вставляется в проектор, метка окажется в правом верхнем углу, под большим пальцем правой руки.
10.5. Хранение отпечатков
Все отпечатки должны быть снабжены серийным номером пленки и эмульсии, а также кратким описанием. Данную информацию следует писать на обороте фотокарточки или на ее упаковке мягким карандашом или шариковой ручкой. Следует избегать применения фломастеров или водорастворимых чернил, так как на большинстве современных сортов фотобумаги они медленно высыхают, что может привести к появлению пятен на лицевой стороне лежащего снизу отпечатка. Чтобы избежать какого-либо связанного с этим риска, в тех случаях, когда вы посылаете фотографии почтой, складывайте их попарно лицевой стороной друг к другу.
67