Рис. 8.12. Временной анализ изменений интенсивности в заданном участке изображения. Препарат — человеческий фибробласт, нагруженный кальцийзависимым флуорохромом FURA-2. FURA-2 используется для определения изменений в концентрации Са2+ во времени методом деления изображений (разд. 3.3 и [41]). Препарат освещается светом с длиной волны 340 или 360 нм, и получающаяся флуоресценция пропускается через фильтр 500± ±10 нм, после чего два изображения делятся друг на друга. Получающееся изображение содержит информацию о концентрации Са2+, заключенную в интенсивности. Значения отношений от 0—3,00, которые покрывают диапазон биологических концентраций Са2+ (примерно от 0,05 до 5 мкм), переназначаются в градации уровня серого 0—256 (по оси ординат).
Таким образом, изменение яркости изображения означает увеличение концентрации свободного Са2+. Средняя интенсивность в кадре в центре клетки измерялась и наносилась на график как функция времени (абсцисса — 8 с). В данном примере были обработаны 100 кадров, взятых с частотой 12,5 Гц и при пониженном разрешении (128x128 пикселов). Микроскоп Polyvar, Reichert/Cam-bridge Instruments с
кварцевым коллектором, 200-ваттной ртутной лампой и масляно-иммерсионным объективом X100 planfluorite, процессор ARGUS 100 Hamamatsu, размер кадра 62 мкм.
Следует избегать использования в качестве фонового расфокусированное изображение препарата. За редкими исключениями (например, при DIC-микроскопии) при расфокусировании не удаляется вся связанная с образцом информация, и вы рискуете ошибочно вычесть из изображения нужные детали.
8.Теперь, когда вы все установили как следует (чувствительность камеры, освещение и т. д.), запишите изображение фона в память отдельно от изображения препарата и вычтите его аналоговым способом из хранящегося в памяти изображения препарата (до этапа 7 в разд. 2.3). Затем продолжите работу в соответствии
сэтапами 8—10 из разд. 2.3, чтобы менять контраст изображения до получения наилучшей картинки.
3.2.3.Получение изображений подвижных объектов
5.Как в разд. 3.2.2.
6.Получите изображение фона, как описано в разд. 3.2.2., этап 7. Лучше, чтобы это фоновое изображение было проинтегрировано или усреднено в течение такого же промежутка времени, какой будет использован для постоянного усреднения на следующем этапе. Это изображение следует поместить в память, где оно может вычитаться из каждого кадра, как при VEC-микроскопии.
7.Вернитесь к изображению препарата и начните вычитание фона в реальном времени, как описано в разд. 2.3, этап 7. Если фон велик, то процесс его вычитания может привести к уменьшению интенсивности изображения. Если это происходит, то для восстановления интенсивности или яркости добавьте цифровым способом сигнал, аналогичный напряжению смещения.
8.Примените процедуру постоянного или экспоненциально модулированного усреднения к изображению с вычтенным фоном, как указано в разд. 2.3, этап 9. Этот вид усреднения приводит к такому же увеличению отношения сигнал/шум (отношение равно (2/n—1), где n — число кадров), как и то, которое происходит в результате интегрирования, использующегося для статичных картин (разд. 3.2.2, этап 6), но имеет то преимущество, что может быть применен к изображениям динамичных препаратов. Кроме того, в отличие от интегрирования изображения, усреднение его не приводит к насыщению или переполнению видеопамяти.
9.Измените контраст изображения цифровым способом, как указано в разд. 2.3, этапы 8 и 10.
3.3. Типичные приложения
3.3.1. Цитохимия с использованием флуоресцентных аналогов
Цитохимический метод с использованием флуоресцентных аналогов состоит в том, что интересующие исследователя молекулы или органеллы выделяются, связываются с флуоресцентной меткой и вводятся обратно в живые клетки [40]. В идеале изображения, создаваемые этими аналогами, должны соответствовать распределению нативных молекул или органелл и характеризовать изменения их распределения во времени. С
175
помощью данного метода была изучена полярность и скорость включения аналогов тубулина и актина в клеточные структуры in vivo, а также были описаны изменения распределения в цитоплазме различных молекул.
3.3.2. Картирование отношений
Картирование отношений — это мощный метод для определения пространственной и временной динамики ионов, молекул и органелл в живых клетках (разд. 4 и рис. 8.12). По отношению двух изображений или их частному можно определять приведенные значения оптического пути и исследуемого объема и таким образом проводить количественные измерения внутриклеточных параметров. Флуоресцентная микроскопия с относительными изображениями была с успехом применена для изучения динамики внутриклеточной концентрации Са2+ и рН [41—43]. Эти исследования стали возможными благодаря использованию флуоресцентных зондов, которые обладают дифференциальной чувствительностью длины волны возбуждения к кальцию (FURA-2) или рН (BCECF). Относительное изображение, рассчитанное по двум изображениям, полученным при разных длинах волн, превращается в изображение, демонстрирующее концентрацию внутри клеток свободных ионов Са2+ или ионов Н+ (рН). При этом используются калибровочные кривые, полученные для растворов данных веществ в буферах.
3.3.3. Восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP-метод)
Исследования латеральной подвижности и диффузии сквозь мембраны получили значительный импульс в результате применения видеоусилительной микроскопии. В этом методе участок цитоплазмы или мембраны, содержащий флуоресцентный зонд, обесцвечивается с помощью лазера или другого мощного источника света. На основе данных о скорости и характере восстановления флуоресценции в обесцвеченном районе определяют роль изотропной диффузии, анизотропной диффузии и направленного потока молекул в латеральном переносе, происходящем в живых клетках [44, 45]. Данный метод получил название пространственной фотометрии с временным разрешением (TRSP, от англ, time-resolved spatial photometry).
3.3.4. Визуализация молекул
С помощью VIM-метода был изучен ряд макромолекул, включая ДНК и актин, которые для этого ковалентно метили флуоресцирующими группами [46, 47]. Визуализация одиночных молекул ДНК в растворе позволила исследовать изменения конформации молекулы. Была изучена также структура хроматина в изолированных ядрах и интактных клетках. Подобным же образом исследовали конформацию одиночных актиновых филаментов и их движение по иммобилизованному миозину [47].
3.3.5. Видеомикроспектрофлуориметрия при освещении низкой интенсивности
Преимущество телекамер с усилением перед фотоумножителями состоит в том, что камеры дают полноценное изображение, а следовательно, позволяют проводить спектральный анализ с пространственным разрешением [48]. Данная техника открывает большие возможности при работе in vivo, поскольку многие из флуорохромов, применяемых для наблюдения за физиологическими изменениями в живых клетках, демонстрируют изменения квантового выхода, ширины спектра (возбуждения и флуоресценции) и спектральных характеристик.
3.3.6. Люминесценция
Появившиеся недавно в продаже телекамеры, способные работать в режиме определения отдельных квантов, открыли возможность для исследования чрезвычайно слабых излучений, характерных для некоторых люминесцентных соединений. Так по люминесценции экворина были визуализированы изменения в распределении кальция при оплодотворении [49]. Другим, действительно замечательным приложением VIMметода оказалась прямая визуализация экспрессии генов в живых клетках. Для этой цели использовался luxоперон, служивший «сообщающим» геном. Этот ген, кодирующий фермент люциферазу, мог быть встроен в клетку таким образом, что его транскрипция контролировалась промотором исследуемого гена. Соответственно активация промотора приводила к эмиссии света [50, 51].
3.3.7. Нейробиология
В нейробиологии применение VIM-метода открыло неожиданные экспериментальные возможности. Он позволяет, например, подобрав нетоксичные и неметаболизируемые красители, проследить во времени за нервными клетками млекопитающих и стабильностью их связей в живых объектах. Используя соответствующие красители, можно окрашивать нервно-мышечные окончания так, чтобы окраска сохранялась в течение нескольких месяцев, и затем, проделав небольшую операцию, повторно исследовать иннервацию поверхностных мышц [52]. Потенциал-зависимые флуоресцентные красители могут быть использованы при малых увеличениях микроскопа для наблюдения за электрической активностью мозга позвоночных, позволяя получить лучшее пространственное разрешение, чем при электроэнцефалографии [53]. С помощью больших увеличений можно на срезах ткани и отдельных клетках получить информацию о мембранных потенциалах
176
[54].
Подробная информация о спектральных свойствах и возможном использовании всех упомянутых выше красителей, а также о соответствующих исследованиях суммировано в обзоре [55]. Красители могут быть получены от таких компаний, как Eastman-Kodak, Sigma Chemicals, и в особенности от фирмы Molecular Probes Inc. (Eugene, шт. Орегон, США), которая специализируется на выпуске флуорохромов.
4. Количественный анализ в живых клетках с помощью видеотехники
До появления видеотехники извлечение количественных данных из полученных в микроскопе изображений было достаточно утомительным занятием. Оцифровка изображения и обработка его в цифровой форме с помощью видеопроцессора позволяют сравнительно легко определять множество различных количественных параметров (разд. 4, гл. 7). Преимущество видеомикроскопии состоит еще и в том, что изображения уже имеют видеоформат и находятся на магнитной ленте или лазерном диске, поэтому их можно анализировать с помощью аналоговых устройств (разд. 1.4.6), например для определения интенсивности вдоль выбранной линии (рис. 8.4) или для измерения расстояний. Однако аналоговые приборы значительно менее удобны, чем цифровые видеоанализаторы.
Большинство цифровых процессоров для видеомикроскопии снабжены препроцессорами для обработки видеосигнала в реальном времени, которые дают на выходе аналоговый видеосигнал, предназначенный для монитора или видеомагнитофона. Если вы хотите освоить некоторые из огромного множества методов цифрового анализа изображений, то как правило для этого требуется специальное оборудование, описанное в гл. 7. При этом аналоговый видеосигнал необходимо будет использовать непосредственно в качестве входного сигнала. Лишь некоторые наиболее дорогостоящие компьютеры способны проводить обработку изображения в реальном времени (разд. 1.4.3, 1.4.4 и 1.4.7) и выполнять большинство необходимых для этого операций с помощью своего собственного процессора. Третий путь — это использование прямой связи компьютера (DMA, от англ, direct memory access — память прямого доступа) с памятью процессора реального времени и какимлибо дополнительным цифровым анализатором изображения.
В качестве первого уровня анализа достаточно выбрать и проанализировать один кадр (гл. 7). Поскольку, однако, видеомикроскопия дает новые возможности для исследования живых объектов, мы хотим иметь возможность анализировать изменения в последовательности видеоизображений. В зависимости от сложности алгоритмов, необходимых для выявления интересующих вас деталей изображения, оказывается возможным или невозможным наблюдать происходящие изменения в реальном времени, т. е. при скорости 25 или 30 кадров в секунду. Если это невозможно, то изображения живых объектов отбираются с микроскопа или с видеомагнитофона так, чтобы анализатор изображения обрабатывал только каждый второй, четвертый, пятый и т.д. кадр, выделяя из него детали и сохраняя информацию для дальнейшего представления в виде функции или графика (рис. 8.12).
4.1. Пространственные измерения
Из изображения можно извлечь такие параметры, как величина, длина, площадь, периметр, координаты центра для одного или более объектов, которые могут быть выделены благодаря своему индивидуальному уровню серого. Это достигается путем задания верхнего и нижнего критических уровней (бинаризация изображения) — действия, которое может выполняться автоматически и в реальном времени несколькими процессорами. При этом кроме обычных измерений можно производить анализ движения, например роста объекта (ядра, клетки, микротрубочки) или движения индивидуальных органелл внутри клетки или вдоль свободных (выделенных) микротрубочек [8, 9, 29, 30, 36—39].
В нашей лаборатории проводится определение координат концов микротрубочек для измерения скорости сборки/разборки субъединиц микротрубочек и исследования подвижности органелл. Для этого разработана следующая методика.
1.Запишите картины, получающиеся в результате обработки последовательных изображений при AVEC- DIC-микроскопии процессором реального времени, на видеомагнитофон (в памяти компьютера можно хранить лишь ограниченное количество кадров, так как 512x512x8 бит изображения занимают 1/4 мегабайта памяти).
2.Проиграйте последовательность кадров назад через X-Y-трекер (С-1055, фирма Hamamatsu Photonics К- К-). Он позволяет выделить яркий объект, устанавливая (порог серого с помощью выбранной пользователем маленькой рамки, которая может двигаться подобно курсору по экрану монитора.
3.Рамка автоматически занимает свое место в центре частицы. Выведите ее координаты через последовательный или параллельный интерфейс на персональный компьютер. Это может быть сделано в реальном времени или медленнее, как вам удобно.
4.Дальнейший анализ положения частицы во времени производится с помощью персонального компьютера
сиспользованием специального программного обеспечения для анализа подвижности [38, 39].
5.Составьте график зависимости координат по осям х и у для того, чтобы проследить за движением объекта.
6.Составьте график зависимости положения от времени для того, чтобы получить функцию скорости. На графике могут быть также представлены в виде функции положения или времени процессы ускорения и изменения направления движения.
177