- •ПРЕДИСЛОВИЕ ПЕРЕВОДЧИКА
- •ПРЕДИСЛОВИЕ
- •СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
- •1. Введение
- •1.1. Освещение по Кёлеру
- •1.1.1. Принципы метода
- •1.1.2. Предварительная проверка оборудования
- •1.2. Установка света по Кёлеру
- •2.1. Преломление
- •2.1.1. Числовая апертура
- •2.2. Отражение, поглощение и пропускание
- •2.3. Флуоресценция/фосфоресценция
- •2.4. Поляризация
- •2.5. Дифракция
- •2.5.1. Тестовые пластинки Аббе
- •2.5.2. Формирование первичного изображения
- •2.5.3. Разрешающая способность
- •2.5.4. Роль конденсора в разрешении микроскопа
- •2.5.5. Увеличение
- •2.5.6. Увеличение и разрешение
- •4. Поле зрения
- •5. Резюме
- •6. Литература для дальнейшего чтения
- •1. Введение
- •1.1. Определение контраста
- •2. Светлопольная микроскопия
- •3. Фазовый контраст
- •3.2. Дифрагированный свет в фазовом контрасте
- •4. Темнопольная микроскопия
- •4.1. Освещение по Рейнбергу
- •4.2. Темнопольные конденсоры высокого разрешения
- •4.3. Темнопольное изображение
- •5. Поляризованный свет
- •5.1. Использование одиночного поляризатора
- •5.2. Использование скрещенных поляризаторов
- •5.2.2. Направление двулучепреломления
- •6.3. Интерференционная отражательная микроскопия
- •6.3.2. Физические основы метода
- •6.3.3. Интерпретация результатов
- •7.1. Красители
- •7.2. Использование светофильтров
- •7.3. Срезы
- •7.4. Качество препарата
- •8. Другие методы
- •8.1. Дисперсионное окрашивание
- •10. Благодарности
- •11. Литература
- •ФИКСИРОВАНИЕ ИЗОБРАЖЕНИЯ
- •1. Введение
- •2. Рисование
- •3. Фотомикрография
- •4.1. Разрешение
- •4.2. Разрешающая способность и размер отпечатка
- •4.4. Освещение
- •5. Микроскоп для фотомикрографии
- •5.1. Штатив микроскопа
- •5.2. Оптика
- •5.2.1. Числовая апертура и увеличение объективов
- •5.2.2. Исправление аберраций
- •5.2.4. Иммерсионные объективы
- •5.2.5. Глубина резкости
- •5.2.6. Кривизна поля зрения
- •5.2.7. Типы конденсоров
- •5.2.8. Чистка линз
- •6. Камера для фотомикрографии
- •6.1. Выбор размера пленки
- •6.3. Специальная фотомикрографическая камера
- •6.4. Микроскопы со встроенными фотосистемами
- •6.5. Камера с мехами
- •7. Наведение на фокус и определение экспозиции
- •7.1. Наведение на фокус
- •7.2. Определение экспозиции
- •7.3. Контроль экспозиции
- •8. Выбор условий для фотомикрографии
- •8.1. Фотографический процесс
- •8.1.1. Чувствительность пленки
- •8.1.2. Зернистость
- •8.1.3. Контрастность
- •8.2. Черно-белая фотомикрография
- •8.3. Цветная фотомикрография
- •8.3.1. Цветные отпечатки или слайды
- •8.3.2. Печать со слайдов
- •8.3.3. Цветовая температура
- •8.3.4. Коррекция цветовых искажений
- •8.3.6. Выбор чувствительности пленки
- •8.4. Поляроидные клетки
- •8.4.2. Камера Поляроид SX70
- •8.4.3. Поляроидные слайды
- •8.5. Хранение неэкспонированной пленки
- •9. Фотомакрография
- •9.1.1. Стереомикроскопы для фотомикрографии
- •9.1.2. Макроскопы
- •9.1.3. Фотомакрографические объективы
- •9.2. Освещение для фотомакрографии
- •9.3. Определение экспозиции при фотомакрографии
- •10. Завершение процесса фотомикрографии
- •10.1. Содержание записей
- •10.2. Хранение негативов
- •10.3. Хранение слайдов
- •10.4. Монтаж слайдов
- •10.5. Хранение отпечатков
- •10.6. Определение и указание увеличения
- •11. Практическое руководство
- •11.2. Начальная калибровка экспонометра
- •12. Литература для дальнейшего чтения
- •ИММУНОГИСТОХИМИЯ
- •1. Введение
- •2. Антитела
- •2.1. Структура иммуноглобулинов
- •2.2. Поликлональная антисыворотка
- •2.3. Моноклональные антитела
- •2.4. Очистка антител
- •2.5. Специфичность реакций антител
- •2.6. Хранение антител
- •3.1. Выбор условий обработки ткани
- •3.2. Выявление скрытых антигенов
- •4. Выбор способа мечения
- •4.1. Флуоресцентные метки
- •4.2. Ферментные метки
- •4.2.1. Пероксидаза хрена
- •4.2.2. Щелочная фосфатаза
- •4.2.3. Глюкозооксидаза
- •4.2.4. Галактозидаза
- •4.3. Коллоидное золото
- •4.4. Выбор метки
- •5. Методы окраски
- •5.1. Прямой метод
- •5.2. Непрямой метод
- •5.4. Системы с использованием биотин — авидина
- •5.5. Другие методы
- •6. Экспериментальные методы
- •6.1. Общее описание метода
- •6.2. Выбор правильного разведения антител
- •6.3. Флуоресцентные метки
- •6.4. Пероксидаза
- •6.4.1. Ингибирование эндогенного фермента
- •6.5. Щелочная фосфатаза
- •6.5.1. Блокирование эндогенного фермента
- •6.5.2. Мера предосторожности
- •6.6. Глюкозооксидаза
- •6.7. Галактозидаза
- •6.9. Некоторые общие процедуры
- •6.9.1. Покрытие предметных стекол
- •6.9.2. Дополнительное окрашивание
- •7.1. Контрольные препараты
- •7.2. Решение проблем
- •9. ДНК-зонды для гибридизации in situ
- •9.1. Принцип метода гибридизации
- •9.2. Экспериментальная процедура
- •9.2.1. Выявление Y-хромосомы
- •9.2.2. Выявление цитомегаловируса
- •10. Цитологические препараты
- •11. Количественная оценка
- •12. Оборудование
- •13. Благодарности
- •14. Литература
- •ГИСТОХИМИЯ И СВЕТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ
- •1. Введение
- •1.1. Объекты для гистохимического окрашивания
- •1.1.1. Что такое окрашивание?
- •2. Приготовление и хранение срезов препаратов
- •2.1. Необходимые характеристики препарата
- •2.2. Методы приготовления и хранения препаратов
- •2.2.1. Получение тонких слоев
- •3. Что можно выявлять? Некоторые примеры
- •3.1. Выявление химических свойств
- •3.1.1. Химические фрагменты
- •3.1.2. Специфические вещества
- •3.1.3. Классы веществ
- •3.2. Выявление биологических объектов
- •3.2.1. Биологические объекты
- •3.2.2. Биологические процессы
- •3.3. Морфологические исследования
- •4. Выбор методов
- •5.1. Оценка селективности методов
- •5.2. Оценка локализации окрашивания
- •5.4. Оценка чистоты реагентов
- •5.5. Номенклатура реагентов
- •6. Что необходимо для гистохимической работы
- •6.1. Оборудование и материалы
- •6.2. Как научиться работать?
- •7. Почему используются гистохимические методы
- •8. Благодарности
- •ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ
- •1. Введение
- •2. Флуорохромы
- •3. Флуоресцентный микроскоп
- •3.1. Способы освещения
- •3.1.1. Освещение проходящим светом
- •3.1.2. Освещение падающим светом
- •3.2. Источники света
- •3.3. Домики для ламп
- •3.4. Фильтры
- •3.4.1. Возбуждающие фильтры
- •3.4.2. Запирающие фильтры
- •3.4.3. Цветные светоделительные зеркала
- •3.5. Объективы и окуляры
- •4. Применение флуоресцентных красителей
- •4.1. Нуклеиновые кислоты
- •4.1.1. Прижизненное окрашивание флуорохромами
- •4.2. Иммунофлуоресценция
- •4.3. Флуоресценция нейромедиаторов
- •4.4. Двойное окрашивание
- •5. Микрофлуориметрия
- •5.1. Введение
- •5.2. Стандарты флуоресценции
- •5.3. Оборудование
- •5.3.1. Инвертированные микрофлуориметры
- •5.3.2. Сканирующие микрофлуориметры
- •5.4. Измерения содержания ДНК
- •5.4.1. Оборудование
- •5.4.2. Подготовка материала
- •5.4.3. Процедура окрашивания
- •5.4.4. Проведение измерений
- •6. Анализ изображения при флуоресценции
- •7. Сканирующая лазерная микроскопия
- •8. Литература
- •МИКРОМЕТРИЯ И АНАЛИЗ ИЗОБРАЖЕНИЯ
- •1. Введение
- •2. Простая микрометрия
- •2.1. Измерения длины
- •2.1.3. Окуляр-микрометр сдвига
- •2.1.4. Другие методы измерения длины
- •2.2 Измерения углов
- •2.3. Измерение толщины
- •2.4. Счетные камеры
- •2.4.2. Техника работы с гемоцитометром
- •3.1.1. Определение АA в двухфазном препарате
- •3.2. Принципы измерения площади поверхности
- •4. Измерения с использованием дигитайзера
- •5.2. Измерения с помощью компьютера
- •6. Приборы и математическое обеспечение работ
- •7. Литература
- •ВИДЕОМИКРОСКОПИЯ
- •1. Видеомикроскопия и оборудование для нее
- •1.1. Введение
- •1.1.1. Видеоусиление
- •1.1.2. Видеоинтенсификация
- •1.1.3. Цифровая обработка изображения
- •1.2.1. Условия ограниченного числа фотонов
- •1.3. Различные методы видеомикроскопии
- •1.3.1. Видеомикроскопия с усилением
- •1.3.2. Аналоговое усиление контраста
- •1.3.3. Цифровая обработка изображения
- •1.4.1. Камеры и контроллеры камер
- •1.4.5. Видеопроцессорные платы
- •1.4.6. Монофункциональные процессоры
- •1.4.7. Взгляд в будущее
- •1.5. Условия, налагаемые на микроскоп
- •1.6. Как соединить телекамеру с микроскопом
- •2.1. Различные виды VEC-микроскопии
- •2.2. Приготовление препаратов
- •2.3. Получение изображения
- •2.4. Интерпретация изображений
- •2.5. Типичные применения и ограничения метода
- •2.5.1. Светлопольная микроскопия
- •2.5.2. Темнопольная микроскопия
- •2.5.4. Фазовый контраст
- •2.5.5. Поляризационная микроскопия
- •2.5.7. Отражательная контрастная микроскопия
- •2.5.8. Флуоресцентная микроскопия
- •2.5.9. Примеры применения в биологии и биохимии
- •3.1. Введение
- •3.2. Процесс формирования изображения
- •3.2.1. Условия, касающиеся микроскопа
- •3.2.2. Получение статических изображений
- •3.2.3. Получение изображений подвижных объектов
- •3.3. Типичные приложения
- •3.3.2. Картирование отношений
- •3.3.4. Визуализация молекул
- •3.3.6. Люминесценция
- •3.3.7. Нейробиология
- •4.1. Пространственные измерения
- •4.2. Измерения по интенсивности
- •5.1. Видеозапись и редактирование
- •5.1.1. Стандарты видеотехники
- •5.1.2. Форматы видеопленок
- •5.1.3. Качество видеопленок
- •5.1.4. Видеомагнитофоны
- •5.1.5. Видеомагнитофоны с цейтраферной записью
- •5.1.6. Запись при видеомикроскопии
- •5.1.8. Копирование и редактирование видеозаписей
- •5.2.1. Оборудование
- •5.3. Перенос видеозаписей в видеофильм
- •5.4. Рисование с монитора
- •6. Благодарности
- •7. Литература
- •1. Введение
- •2. Классификация сегментов хромосом
- •2.1. Гетерохроматиновые сегменты
- •2.2. Эухроматиновые сегменты
- •2.3. Ядрышковые организаторы
- •2.4. Кинетохоры
- •4.2. G-окрашивание
- •4.2.1. ASG-метод
- •4.2.3. Метод Галлимора и Ричардсона
- •4.3. R-окрашивание
- •4.4. Q-окрашивание
- •4.4.1. Q-окрашивание с помощью акрихина
- •4.5.2. Процедура окраски
- •5.1. Окрашивание ДАФИ/дистамицином
- •5.2.1. Метод культивирования клеток
- •5.2.2. Методика окраски
- •5.3.2. Синхронизация с помощью БУДР [39]
- •5.3.3. Синхронизация с помощью ФУДР [13, 40]
- •6. Наблюдение и регистрация сегментов хромосом
- •6.3. Фотографирование сегментированных хромосом
- •6.4.1. Получение профилей сегментов
- •6.4.2. Отражательная микроскопия
- •6.4.3. Измерение полиморфизма хромосом
- •7. Благодарности
- •8. Литература
- •9. Литература для дальнейшего чтения
усреднителя, интегрируя изображение примерно от четырех кадров. Это уменьшает шум, но может быть совершенно неприемлемо при съемке быстро движущихся объектов. В таких случаях лучше фотографировать стоп-кадры. Нажатие кнопки «Пауза» приводит к остановке на экране только одного поля, которое содержит половину линий развертки. В результате вы имеете изображение с отчетливо видимыми линиями развертки. Поэтому-лучше хранить (замораживать) в видеопроцессоре целый кадр (два поля). Тогда имеются и дополнительные возможности улучшения изображения, например за счет контроля усиления и напряжения смещения на телекамере. Во всех случаях фотография со стоп-кадра содержит больше точечного шума и получается менее четкой, чем фотография с движущейся пленки. Стоп-кадром следует пользоваться только тогда, когда имеются очень быстрые движения, которые будут размыты при других способах съемки.
Всегда, когда есть возможность, фотографии следует делать с первичного изображения, идущего на монитор прямо с телекамеры или из видеопроцессора. Картины, получающиеся при проигрывании записи на видеомагнитофоне, обычно хуже и имеют более низкое разрешение. Однако с оригинальной пленкой, на которой хранится запись, следует обращаться осторожно, так как долгие периоды работы в режиме «Пауза» и интенсивный поиск нужных мест путем перемотки пленки вперед и назад приводят к ухудшению качества записи.
Делайте заметки по каждому кадру, указывая все детали, необходимые для оптимизации настройки фотокамеры и идентификации заснятых картин.
5.3. Перенос видеозаписей в видеофильм
Показывать видеофильм большой аудитории лучше всего с помощью видеопроектора. Этот прибор обычно дает большое и яркое изображение на обычном экране, еще лучше оно выглядит на отражающем экране. Однако из-за своей высокой цены видеопроекторы доступны не для любого института. Если демонстрировать с помощью цветного видеопроектора черно-белые записи, то контраст получается намного более низким, и большой экран использовать невозможно.
С другой стороны, кинопроекторы для 16-миллиметровой пленки можно найти практически в любом конференц-зале. Так что во многих случаях 16-миллиметровый фильм (единый стандарт во всем мире) демонстрировать гораздо проще. Для показа видеофильма нужен видеомагнитофон и, по крайней мере, один большой телевизионный монитор, на котором можно достаточно хорошо видеть изображение только с близкого расстояния. Кинофильм, демонстрируемый через проектор, наоборот, позволяет получить достаточно большое и яркое изображение, которое хорошо видно всей аудитории.
Если правильно перенести видеоизображение на кинопленку, качество его не ухудшается. При киносъемке с телевизионного экрана в общем возникают те же проблемы, что и при фотосъемке, поэтому для этих целей рекомендуется использовать сетку Рончи или монитор с повышенным разрешением (разд. 5.2.2).
Для съемки можно использовать черно-белую или цветную, негативную или обратимую пленку. Однако с обратимых пленок нельзя делать копий на тот случай, если оригинал повредится или пропадет. Кроме того, пленки с обратимой эмульсией следует очень точно экспонировать, так как они крайне чувствительны и к недодержке, и к передержке.
Использование негативной (черно-белой или цветной) пленки обходится, однако, дороже, чем использование обратимой пленки. Мы получаем самые лучшие результаты при работе с черно-белыми пленками Kodak Double-X (Eastman) и Gevapan 36 (Agfa-Gevaert), которые экспонируем на 2/3 этапа ASA
больше, чем указано (что соответствует компенсации — 2/3 по f-точке). После проявления лаборатория возвращает негатив и предварительную позитивную копию. Эту копию можно разрезать и смонтировать на монтажном столике. В начале и в конце пленки мы добавляем по 1,5—2 м черной или цветной пленки (зеленой в начале и красной в конце). Качество такой первичной копии обычно вполне подходит для демонстрации, но если мы хотим иметь копию лучшего качества, то должны монтировать соответственно и негативную пленку. Последнюю работу, чтобы не повредить оригинальный негатив, следует делать только на профессиональном оборудовании. Из смонтированного негатива можно сделать столько копий, сколько допускается без потери качества, причем даже неправильная экспозиция может быть при копировании в значительной степени скомпенсирована.
Основной проблемой при переносе видеоизображения на кинопленку является синхронизация обтюратора кинокамеры с разверткой (25 или 30 кадров в секунду). Неправильная синхронизация приведет к появлению темных горизонтальных или наклонных полос, которые будут перемещаться по экрану вверх или вниз. Для того чтобы иметь постоянную и контролируемую скорость вращения обтюратора, необходима камера с электронным управлением, желательно с кварцевым генератором, такая как Arriflex 16SR (Arnold and Rlchter Cine Technik GmbH), или СР 16-GSMO (Cinema Products Corporation). Эти камеры могут контролироваться извне видеочастотным сигналом, получаемым с видеовыхода, например видеомагнитофона, или беспроволочным способом через синхронизирующий излучатель. В последнем случае приемник индуцирующего сигнала от специального «контроллера фазы» помещается вблизи монитора, или, если монитор сделан в металлическом корпусе, около его раскрытой задней части. Блок управления контроллера фазы соединяется с приемником и разъемом кинокамеры для внешней синхронизации (рис. 8.16). Ручка на блоке управления позволяет оператору слегка уменьшать или увеличивать скорость вращения обтюратора, вызывая тем самым смещение черной полосы (которая может появиться в начале съемки) вверх или вниз по
187
изображению (рис. 8.17). Соответственно полоса будет оставаться вне кадра до тех пор, пока не появится следующий видеокадр с шумом (вызванным, например, неправильным редактированием), что потребует нового «сдвига» полосы. Блок управления контроллером фазы может быть установлен на любой видеостандарт (50 Гц для PAL/SEKAM; 60 Гц для NTSC). Оборудование для данных целей можно найти в видео- и звукозаписывающих центрах больших институтов или взять напрокат на один или несколько дней у компаний, занимающихся прокатом кинематографического оборудования (примерная цена — 300$ в день).
Рис. 8.16. Оборудование для 16миллиметровой пленки, использованное авторами для пересъемки на пленку с видеофильма. Камера Arriflex 16 SR с блоком управления (в центре), регулирующим фазу обтюратора, и блоком сенсорного управления (впереди).
Кинокамера, так же как и фотокамера, устанавливается на стабильной треноге и направляется точно на экран. Мы получили хорошие результаты с камерой Arriflex 16SR, снабженной объективом Zeiss 1,3/25 мм и сеткой Рончи. Требуемую диафрагму можно определить с помощью встроенного или отдельного экспонометра. Первый позволяет контролировать диафрагму во время съемки и компенсировать изменения яркости между разными сценами.
Поскольку скорость пленки составляет 24 кадра в секунду, то перенос с видеопленки на кинопленку приводит к замедлению всех записей (на 4% по сравнению с оригиналом в случае PAL/SEKAM и на 20% в случае NTSC). Перенос без этого эффекта производится некоторыми коммерческими видеостудиями. Пленки (16- и 35-миллиметровые) высокого качества, с копиями видеозаписей выпускаются Image Transform Inc., которая применяет для этой цели переменную электронную развертку. Поскольку получающиеся негативы не содержат линий развертки и обладают хорошим контрастом, они могут использоваться для получения фотоотпечатков.
Эффект ускорения может быть достигнут за счет ручного управления скоростью съемки. Так например, чтобы получить
Рис. 8.17. Последовательность кадров на 16-миллиметровой пленке, снятой с монитора. Л. Без синхронизации в начале сюжета. Б и В. С помощью индуктивного синхронизатора темная полоса за короткий промежуток времени удаляется, ускорение в фильме в 5 раз, необходимо установить скорость 10 полукадров в секунду (PAL/SEKAM) или 15 полукадров в секунду (NTSC). Уменьшенная скорость должна быть скомпенсирована соответствующим закрыванием диафрагмы, чтобы избежать избыточной экспозиции пленки. Разумеется, можно отснять с монитора и сохраненный кадр (стопкадр). Возникающие при этом темные полосы следует удалить, как было описано выше.
Изготовить титры очень легко. Напечатайте их на белой бумаге с помощью пишущей машинки с четким шрифтом. Чтобы получить негатив с белыми буквами на черном фоне, сфотографируйте титры на высококонтрастную черно-белую пленку (например, Agfaortho 25). Эти смонтированные негативы можно спроецировать на экран и заснять с нормальной скоростью (24 кадра в секунду). Продолжительность плана с титрами зависит от объема информации (разд. 5.1.8, I).
188