3 курс / Фармакология / Интеллектуальные_липидные_наноконтейнеры_в_адресной_доставке_лекарственных

109

Идентификация различных путей эндоцитоза и процессов транспортировки эндоцитируемого материала в цитоплазме является сложной задачей. Для ее решения используют разнообразные ингибиторы и маркеры, позволяющие специфически влиять на динамику различных процессов, а также различить клеточные компартменты (Табл.1).

3.2.4. Внутриклеточная адресация частиц

Внутриклеточная адресация предполагает доставку веществ к определенным компартментам клетки. Различают адресацию к эндолизосомальному, цитоплазматическому, митохондриальному и ядерному компартментам [2].

Адресация к лизосомам необходима для терапии заболеваний, связанных с дисфункцией лизосом. К таким заболеваниям относят болезни Тея-Сакса, Гоше, синдром Леша-Нихена или недостаточность аденозин диаминазы. Лечение этих заболеваний основано на доставке в лизосомальный компартмент недостающих ферментов [838]. Кроме того, доставка лекарственных веществ к лизосомам позволяет лечить такие паразитарные заболевания, как сонная болезнь (трипаносомоз), лейшманиоз, токсоплазмоз, малярия, амебиазы, лямблиоз [839]. Доставка наночастиц к лизосомам в значительной степени зависит от их поверхностного заряда [840]. В некоторых случаях было замечено, что частицы, имеющие отрицательный поверхностный заряд, обычно доставляются в лизосомы, тогда как частицы, меняющие заряд на положительный в кислой среде поздних эндосом способны задерживаться в эндосомальном компартменте [841].

Доставка веществ к митохондриям необходима для лечения заболеваний, связанных с дисфункцией митохондрий, среди которых следует назвать болезни Альцгеймера, Паркинсона, ишемию, инсульт [842,843], некоторые миопатии [844]. Среди агентов, доставляемых в лизосомы, следует назвать антиоксиданты [845,846], естественные компоненты метаболизма [847], вещества, влияющие на метаболические пути, например, метаболизм жиров в митохондриях, что существенно в предотвращении ишемии [848]. В некоторых случаях, наоборот, требуется вызвать гибель митохондрий для инициации апоптоза клеток опухоли [849,850]. Благодаря наличию значительного отрицательного потенциала, мембраны митохондрий способны накапливать катионные агенты, что может с успехом использоваться для доставки лекарств к митохондриям [851]. Кроме того, недавно был открыт ряд агентов, которые также можно использовать для адресации веществ к митохондриям. К ним относятся: цитоплазматический белок Вах [852], бетулиновая кислота [853], аналоги витамина Е

[854].

110

Доставка веществ в ядро связана, прежде всего, с потребностями генетической трансформации клеток, используемой в генной терапии. [855,856]. Кроме того, в ядро могут доставляться цитотоксические вещества для инициации гибели клеток опухоли [857-859]. Для доставки веществ в ядро могут использоваться полипептиды, несущие сигнал ядерной локализации [600], или ТАТ-пептиды, полученные из белка вируса ВИЧ [602,603]. Более подробно эти процессы будут обсуждаться в соответствующих разделах книги.

3.3. Адресация к рецепторам фолиевой кислоты

3.3.1. Фолат-модифицированные наноконтейнеры

Выше обсуждались возможности пассивной адресации наночастиц в опухоли, которая является следствием повышенной проницаемости сосудов опухолевой ткани для частиц малого размера (эффект повышенной проницаемости и удержания). Использование специфических рецепторов на поверхности клеток позволяет не только усилить эффективность адресации частиц, но и расширить список мишеней, к которым осуществляется доставка лекарственных веществ. Одной из наиболее часто используемых мишеней является рецептор фолата. Рецепторы фолата, известны также как фолат связывающие белки [860]. Существует, по меньшей мере, четыре изоформы фолат-рецептора (ФР), обозначаемые как: α-ФР, β- ФР, γ/γ’-ФР и δ-ФР. При этом, α-ФР, β-ФР и δ-ФР являются мембранными белками, прикрепленными к гликозил фосфатидилинозитолу на поверхности клеток [861], тогда как γ/γ’-ФР секретируется лимфоидными клетками в виде водорастворимых белков и не пригодны для адресации частиц

[862,863].

Присутствие ФР в тканях неравномерно [861]. Так, было обнаружено, что δ-ФР экспрессируется в клетках Т лимфоцитов, что можно использовать для адресации наночастиц к этим клеткам [864]. Но наибольший интерес представляют α- и β-ФР. Известно, что α-ФР часто имеет повышенную экспрессию при канцерогенном перерождении эпителиальной ткани, тогда как β-ФР экспрессируется при миелоидной лейкемии, а также на поверхности макрофагов при хронических воспалительных процессах. В нормальных тканях экспрессия этих рецепторов либо полностью отсутствует, либо незначительна [865]. Исключение составляет только экспрессия α-ФР на люминальных поверхностях некоторых эпителиальных клеток [866] где их доступность для наночастиц, находящихся в русле крови, весьма ограничена. В экспериментах на целом организме, включая человека, было показано, что нормальные ткани не накапливают фолат

111

или его производные. Исключение составляют только ткани почек

[867,868].

Необходимо также отметить отличие ФР от широко известного переносчика восстановленного фолата (ПВФ). ПВФ участвует в трансмембранном переносе фолата, его сродство к фолату находится в пределах величин 10-6 М и данный белок экспрессируется во всех клетках, тогда как ФР не является абсолютно необходимым для выживания клеток и его экспрессия в норме чрезвычайно ограничена. При этом, сродство ФР к фолату более чем в 103 раз выше, чем у ПВФ, что позволяет осуществлять адресацию частиц к ФР, не опасаясь побочного действия на ПФВ.

Повышенная экспрессия α-ФР на поверхности опухолевых клеток была обнаружена в начале 90-х годов [866,869,870]. Не все опухоли имеют повышенную экспрессию рецептора фолата, но список заболеваний довольно велик, включая рак яичников, легких, молочной железы, почек, мозга, слизистой матки, прямой кишки. Заболевания, в которых проявляется повышенная экспрессия β-ФР связаны с дисфункцией макрофагов. Они включают ревматоидный артрит, псориаз, атеросклероз, диабет, неспецифический язвенный колит, остеоартрит, гломерулонефрит а также большинство видов воспалительных процессов [867]. Кроме того, β-ФР экспрессируется в 70% острых миелогенных лейкемий. Таким образом, α- ФР является маркером канцерогенной трансформации [871-873], тогда как β-ФР – маркером миелоидной лейкемии и хронических воспалений [874], что можно использовать для лечения некоторых из этих заболеваний

[872,875-877].

3.3.2. Эндоцитоз фолат-модифицированных наноконтейнеров

Было обнаружено, что после взаимодействия фолата с соответствующим рецептором на поверхности клеток, активируются процессы эндоцитоза, в результате чего образующийся комплекс интернализуется в эндосомы, и далее может доставляться в лизосомы, где происходит снижение рН и деградация комплекса [878]. Если к фолиевой кислоте прикреплен некий дополнительный груз, например, лекарственное вещество, он может высвобождаться в цитоплазму. При этом часто бывает необходимо, чтобы груз высвобождался до того, как эндоцитируемый материал попадает в лизосомы. Для этого рецептор фолата можно прикрепить к лекарству через дисульфидный мостик. При увеличении кислотности следы в поздних эндосомах связь разрывается и освободившееся лекарство может выйти в цитоплазму.

Кроме того, было показано, что доставка в лизосомы и биодеградация доставляемых веществ может не происходить [879,880]. Возможно это связано с тем, что значительная часть рецепторов фолата находится на

112

плазматической мембране в областях обогащенных холестерином, так называемых рафтах, и эндоцитируется по кавеолин-зависимому пути [881], который, в отличие от клатрин-зависимого пути эндоцитоза, не приводит к доставке материала к лизосомам.

Сродство фолиевой кислоты к рецептору очень велико. Константа диссоциации комплекса α-ФР с фолиевой кислотой Kd = 10-10 M [882,883], для β-ФР величина Kd = 10-9 M [884]. Даже при присоединении фолата к доставляемому грузу, например, в комплексе фолат-рибонуклеаза, константа диссоциации очень мала Kd = 24·10-9 M [885]. Эффективность комплексов фолата с некоторыми токсинами поразительна. Так, было показано, что комплекс фолат-момордин способен вызывать гибель раковых клеток. При этом, концентрация комплекса вызывающая гибель 50% клеток IC50 ≈ 10-9 М [886]. Комплекс фолата с токсином псевдомонады PE38 был еще эффективнее: IC50 ≈ 10-11 М [879].

Поэтому было предложено использовать фолат-рецептор для доставки в клетку различных лекарственных веществ или контейнеров с лекарственными веществами. Для направленной доставки липосом к поверхности клеток можно доставлять как саму фолиевую кислоту, так и антитела к одной из форм рецептора фолата. Благодаря этому, к определенным клеткам можно доставлять лекарственные вещества, различные маркеры и контрастирующие агенты для визуального обнаружения пораженных областей, а также олигонуклеотиды, плазмидную ДНК, гаптены, специфические белковые и полипептидные токсины и т.д. (Рис.8). Так, контейнеры с даунорубицином или доксорубицином могут проникать внутрь клетки что повышает цитотоксичность этих лекарств [887,888]. Рецептор фолата использовался также в нейтроно-захватной терапии, что требовало доставки в клетку атомов бора [889]. Исследовалась также возможность генетической трансформации раковых клеток [890,891].

Использование липосом позволяет увеличить количество доставляемых в клетку молекул лекарственного вещества. Преимуществом использования липосом является также то, что данный подход исключает необходимость химической модификации лекарственного вещества. Кроме того, липосомы, модифицированные фолатом, не накапливаются в почках, как это происходит с малыми молекулами (< 50 кДа). Было обнаружено, что липосомы, в которых фолат был непосредственно прикреплен к молекуле липида, не могли эффективно связываться с фолат-рецептором на поверхности клеток [892]. Напротив, при прикреплении фолата к липосоме с помощью цепочки полиэтиленгликоля (ПЭГ, 3350 Да, длина 250Ǻ) в клетку опухоли проникало более 2,5x105 липосом. При этом каждая липосома диаметром 65 нм в среднем могла содержать более 30 000 молекул лекарства.

113

Рис.8. Структура фолиевой кислоты (а) и некоторых конъюгатов, используемых для доставки радиоактивных изотопов (б,в), флуоресцентных красителей (г) или лекарственных препаратов (д) [868,893-900].

Для увеличения времени циркуляции таких липосом в русле крови было достаточно присутствия около 4% липида, с прикрепленным ПЭГ, при этом фолиевая кислота была прикреплена только к 0,1% молекул ПЭГ [901]. Для этой цели использовались такие конъюгаты, как фолат- полиэтиленгликоль-фосфатидилэтаноламин (фолат-ПЭГ-ФЭ) или фолат- полиэтиленгликоль-холестерин (фолт-ПЭГ-хол) [892,902]. Далее, было обнаружено, что увеличение специфичности доставки лекарства к раковым клеткам может быть достигнуто если: (1) свободные (не модифицированные флатам) молекулы ПЭГ были короче (ПЭГ 2000), чем молекулы с прикрепленным фолатом (ПЭГ 3350), (2) диаметр липосом был < 100 нм, (3) в состав липосом входил холестерин и насыщенные фосфолипиды,

(4) в состав липосом входили пептидные сенсоры рН, инициирующие слияние липосом с мембраной эндосомы и высвобождение содержимого до попадания в лизосомы [903-906].

114

3.3.3. Адресация веществ к рецепторам фолата

С помощью липосом, модифицированных фолатом, исследовали доставку различных лекарственных веществ, среди которых можно назвать доксорубицин [888,901,907], даунорубицин [887,908], арабинофуранозид цитозина [909], паклитаксель [910], радиоактивный бор [889,911], фотосенсибилизаторы [912], антисмысловые полинуклеотиды [913]. В экспериментах по доставке в клетки доксорубицина было показано, что липосомы с прикрепленным фолатом захватывались клетками опухоли в 45 раз эффективнее, чем не модифицированные липосомы. При этом эффективность действия липосом с фолатом была в 85 раз выше, чем таких же липосом без фолата [901]. Более того, доставка доксорубицина с помощью модифицированных фолатом липосом позволяла преодолеть резистентность к данному лекарству, наблюдающуюся у клеток карциномы легких

[914].

Адресация катионных липосом с плазмидной ДНК путем использования липофильных производных фолата показал увеличение противоопухолевой активности гена р53 на фоне обычной хемо- и радиотерапии [915]. Существенного увеличения эффективности трансфекции клеток можно было достичь также при использовании плазмидной ДНК, компактизованной внутри липосом, на поверхности которых находился фолат [916]. В целом, адресация фолатом позволяет достичь существенной улучшения трансфекции опухолевых клеток по сравнению с нормальными [890,917-920]. В экспериментах с липосомами, доставляющими антисмысловые ДНК, было обнаружено, что адресация с помощью фолата позволяла снизить экспрессию фактора роста более чем в 50 раз эффективнее, чем при использовании такой же концентрации свободного полинуклеотида в среде [921]. Прикрепление фолата к поверхности липосом позволяет увеличить доставку антисмысловых ДНК в опухолевые клетки [922-924].

В заключение данного раздела необходимо сделать некоторые замечания, касающиеся сравнения различных способов адресации с помощью фолиевой кислоты [860]. Конъюгаты фолата с малыми молекулами, используемыми для доставки радиоактивных изотопов, лекарств или различных маркеров могут быстро доставляться к клеткам, имеющим рецепторы фолата на поверхности, но они также быстро удаляются из русла крови, что дает очень высокое различие в связывании с клеткамимишенями, по сравнению с остальными клетками. Однако при этом наблюдается значительное накопление лекарств в почках, что может приводить к токсическому эффекту. Липосомы, или наночастицы, содержащие фолат на поверхности, имеют на много большие размеры и меньшую дос-

115

тупность для клеток сò лидных опухолей. Но они доставляют большие количества лекарственного вещества, что иногда дает существенные преимущества. Стерическая стабилизация липосом с помощью ПЭГ позволяет значительно увеличить время их циркуляции в крови, а использование конъюгатов фолат-ПЭГ-липид позволяет осуществлять адресацию липосом. Однако недостатком липосом, модифицированных фолатом, является ускоренное их удаление из русла крови с участием ретикулоэндотелиальной системы (РЭС) по сравнению с обычными стерически стабилизированными липосомами. Это может объясняться большим сродством макрофагов к таким липосомам вследствие наличия некоторой экспрессии β- ФР нормальными макрофагами [925]. Наличие указанных проблем привели к тому, что несмотря на успешное использование фолата в экспериментальных исследованиях на животных, клинические испытания в данной области до сих пор не проводились [860].

3.4. Иммунолипосомы в доставке веществ

Прикрепление антител к поверхности липосом является наилучшим способом их адресной доставки. [926,927]. После специфического связывания с поверхностью клеток липосомы поникают внутрь клетки посредством эндоцитоза. При этом наблюдается обмен липидами между мембранами клетки и липосомами. Поникнув в клетку, липосомы способны высвобождать содержащиеся в них вещества в цитоплазму, благодаря чему достигается нужный терапевтический эффект.

3.4.1. Прикрепление антител к липосомам

Исследования возможности использования антител для адресной доставки липосом были начаты в 70-х годах пошлого столетия [928,929]. Первые попытки использования таких липосом для доставки лекарственных веществ были неудачными, поскольку липосомы быстро удалялись из русла крови клетками ретикулоэндотелиальной системы. Существенный прогресс в этой области был достигнут после создания стерически стабилизированных липосом, покрытых полимерами, например, полиэтиленгликолем (PEG). По характеру прикрепления антител и PEG к поверхности липосом можно выделить три типа иммунолипосом (Рис.9). Тип А – наиболее ранний тип иммунолипосом предполагает прикрепление антител непосредственно к поверхности бислоя фосфолипидов. Как было отмечено выше, такие иммунолипосомы демонстрировали хорошую адресацию in vitro, но их эффективность in vivo была очень низкой [930-932].

116

Рис.9. Различные способы прикрепления антител и полиэтиленгликоля (PEG) к поверхности липосом.

Более эффективными оказались липосомы, в которых, кроме антител, к поверхности бислоя были прикреплены молекулы PEG (Тип Б). Так, было проведено исследование адресации липосом к области инфаркта миокарда с помощью антител против миозина – белка, высвобождающегося из клеток при некрозе [933]. Прикрепление PEG к поверхности липосом приводило к снижению их связывания с поверхностью клеток in vitro, но этот недостаток компенсировался существенным увеличением времени циркуляции этих липосом в крови, что приводило к увеличению эффективности адресации in vivo. Для этого было достаточно 4 моль% PEG

(5000 Д).

Дальнейшее увеличение эффективности адресации достигалось прикреплением антител к концам цепочек PEG (Тип В). Липосомы этого типа были предложены с середине 90-х [934-936]. Данный тип иммунолипосом значительно более эффективен и сейчас наиболее распространен. Длина полимера, к которому прикреплены антитела, не существенно влияет на эффективность адресации. При выборе стратегии прикрепления антител к липосомам необходимо учитывать такие параметры, как эффективность связывания и возможность достичь необходимой плотности антител на поверхности липосом. Наличие антител на поверхности липосом не должно отрицательно влиять на время циркуляции частиц в русле крови и накопление частиц в области нахождения мишени терапевтического воздействия. Липосомы должны сохранять способность удерживать лекарственное вещество при его транспортировке к мишени [926,936,937].

Липосомы, меченные целыми молекулами антител IgG, могут распознаваться макрофагами, что приводит к сокращению времени их циркуляции в крови. Эту проблему можно решить, если использовать Fab или scFv фрагменты антител (Рис.10), которые могут долго циркулировать, при этом, сохраняя высокую эффективность связывания с мишенями. Кроме того, такие иммунолипосомы способны не только эффективно свя-

117

зываться с клетками опухоли, но также эндоцитироваться в цитоплазму, что отличает их от обычных стелс липосом [938,939].

Рис.10. Схематическое изображение молекулы иммуноглобулина человека IgG. Молекула состоит из двух легких и двух тяжелых цепей. Каждая цепь содержит вариабельную область, участвующую в формировании антигенсвязывающих сайтов. Протеолитический фермент папаин расщепляет молекулу иммуноглобулина, в результате чего появляются два фрагмента Fab, содержащие антигенсвязывающие сайты, и один фрагмент Fc. Кроме того, возможно получение четырех фрагментов вариабельной области csFv, сохраняющих способность связывать антигены. На схеме обозначены также области, в которых располагаются дисульфидные мостики. Последние используются для прикрепления антител к липидам

Наиболее популярными методами присоединения антител к PEG являются: 1). Использование группы гидразина на конце цепи PEG, которая прикрепляется к олигосахаридным группам на молекуле антитела. 2). Использование пары биотин-авидин. В данном случае готовят липосомы в состав которых входит биотинилированный PEG с липидом. Далее к липосомам добавляют биотинилированные антитела, а затем – авидин, который связывает оба компонента. 3). Метод в котором группа малеимида (Рис.11), прикрепленная к фосфатидилэтаноламину или к конъюгату этого фосфолипида с PEG, реагирует с тиоловыми группами антител. Использо-

118

вание малеимида является одним из наиболее эффективных методов получения конъюгатов липид-антитело. Процедура прикрепления Fab фрагментов с использованием этого метода подробно описана [937].

Для получения липосом, меченых антителами, применяют метод внедрения конъюгатов антител с липидами в предварительно сформированные липосомы. Такой подход называют «смешиванием и подгонкой» (mix and match) или методом послевставки (post-insertion technique) [940,941]

Для этого используют суспензию мицелл, образованных конъюгатами ли- пид-PEG-антитело, которые при смешивании с предварительно сформированными и загруженными лекарством липосомами внедряются в фосфолипидный бислой, в результате чего формируются готовые к использованию иммунолипосомы. Процедуру производят при 60° С в течение 1 часа. Так, например, иммунолипосомы можно создать, используя готовые коммерческие липосомы Doxil® , содержащие доксорубицин [941,942].

Рис.11. Различные формы прикрепления малеимида к фосфатидилэтаноламину (PE-BMP), или к конъюгату фосфатидилэтаноламина с полиэтиленгликолем (PE- PEG-BMP) и (PE-PEG-малеимид). Где BMP – β-maleimidopropyl

Для внедрения лекарственного препарата в липосомы была разрабо-

тана стратегия «после-загрузки» (after-loading strategy) [943,944] или за-

грузки по градиенту (gradient loading) [945,946]. Липосомы готовят в присутствии плохо проникающего через бислой заряженного вещества, такого как аммониевые соли полифосфата или октасульфата сахарозы, что создает трансмембранный потенциал после удаления этого вещества снаружи. Затем липосомы переносят в раствор лекарственного препарата, ко-