3 курс / Фармакология / Интеллектуальные_липидные_наноконтейнеры_в_адресной_доставке_лекарственных

139

A

Б

Рис.10. Конформационные изменения в гидрофобной области молекулы производного фосфатидилхолина (Bis-Azo-PC), приводящее к изменению упаковки молекул и образованию мицеллярных структур (А). Хромофорная часть, образованная производными азобензола, может находиться также в полярной области молекулы липида KAON12, что также приводит к изменению формы молекулы при освещении, способствуя формированию бислоя с различной степенью кривизны (Б).

140

Цис-транс изомеризация азобензола может изменять упаковку и фазовое состояние липидов. Например, ультрафиолетовое облучение липосом, содержащих светочувствительный фосфатидилхолин Bis-Azo-PC, способно инициировать трансформацию формы молекулы липида из цилиндрической, способной образовывать бислойные структуры липосом, в клиновидную форму, образующую мицеллярные структуры, что приводит к нарушению барьерных свойств бислоя. Изменение конформации обратимо и может регулироваться светом разной длины волны, что позволяет регулировать изменение проницаемости липосом, содержащих 6% Bis- Azo-PC, и способствует высвобождению лекарств, тогда как в темноте липосомы стабильны и непроницаемы для заключенных внутри них веществ [1087-1090]. Поскольку светочувствительный липид присутствует в липосомах в малом количестве, увеличение проницаемости липосом не сопровождается их необратимым разрушением. Напротив, возникают локальные и быстро исчезающие изменения упаковки липидов, благодаря которым происходит обратимое изменение проницаемости бислоя. Использование различных производных фосфатидилхолина, отличающихся величиной полярности и заряда, позволяет изменять чувствительность липосом к свету и скорость высвобождения веществ при разной длине волны и температуре [1091]. Проницаемость и форму липосом можно регулировать также используя азобензол-содержащий липид KAON12, в котором хромофор располагается в гидрофильной части молекулы (Рис.10 б). Было обнаружено, что освещение разными длинами волн позволяет манипулировать формой гигантских моноламеллярных липосом, содер-

жащих смесь KAON12 и DOPC [1092].

4.2.4. Светочувствительные полимеры

Первые светочувствительные мицеллы, образованные блоксополимерами, были созданы в 2004 г. [1093]. Это вызвало большой интерес к данной области исследований. Теоретический анализ позволил сформулировать некоторые общие принципы создания светочувствительных мицелл и липосом [1014,1094]. Для того, чтобы реагировать на освещение мицеллы должны содержать хромофор. В ответ на освещение хромофор может изменять конформацию или отделяться от молекулы полимера, что может приводить к обратимым или необратимым изменениям стабильности мицелл (Рис.11). Для того, чтобы изменения хромофора существенно влияли на стабильность мицелл, желательно, чтобы хромофор был прикреплен к гидрофобной части полимера и находился в ядре мицеллы. В этом случае изменения хромофора могут влиять на величину

141

гидрофобных сил, ответственных за формирование мицелл. Предполагается, что снижение гидрофобности полимера в результате конформационного изменения или отделения хромофора под действием света, может нарушать стабильность мицелл, вызывать их диссоциацию, и приводить к высвобождению лекарственных веществ, заключенных в мицелле.

Рис.11. Мицеллы, образованные чувствительными к свету блок-сополимерами имеют гидрофильную оболочку и гидрофобное ядро. Хромофоры находятся в гидрофобной части полимера и локализуются в ядре. Обратимые конформационные изменения хромофора под действием света могут влиять на стабильность мицелл, вызывая их диссоциацию или восстановление, в зависимости от длины волны (а). Освещение способно также инициировать отделение хромофора, что приводит к необратимой диссоциации мицелл (б).

Примером хромофора, изменяющего конформацию под действием света, является производное азобензола (PAzoMA). Хромофор был прикреплен к высоко гидрофильной цепи полиакриловой кислоты, несущей множество полярных гидрофильных групп: poly(tert-butil acrylate-co- acrylic acid) [P(tBA-co-AA)]. В данной молекуле гидрофобную часть составляет молекула хромофора которая полностью определяет формирование мицеллярных структур (Рис.12 а). Цис-транс изомеризация молекулы азобензола, приводящая к изменению величины дипольного момента, существенно влияет на стабильность мицелл. В темноте или при облучении видимым светом (440 нм) предпочтительна транс-конформация хромофора, при которой формируются мицеллы. Под действием ультрафиолета (360 нм) происходит обратимая изомеризация хромофора, молекула при-

142

обретает некоторую полярность, что существенно дестабилизирует мицеллы [1080,1093]. Процесс обратим и под действием видимого света мицеллярная структура формируется вновь.

Этот принцип фоторегуляции стабильности мицелл путем изменения полярности гидрофобного хромофора является весьма универсальным. Так, блок сополимер, образованный гидрофильным полиэтиленоксидом (PEO), к которому прикреплен гидрофобный блок спиропирана (PSMA) образует мицеллы (Рис.12 б). Однако под действием ультрафиолета происходит изомеризация спиропирана в мероцианин, молекула которого существенно более полярна, что приводит к диссоциации мицелл. Процесс полностью обратим под действием видимого света [1095].

Рис.12. Фотоизомеризация диблоксополимера P(tBA-co-AA)-b-PAzoMA, содержащего в хромофор азобензол (а) или диблоксополимера PEO-b-PSMA, содержащего хромофор спиропиран, прикрепленный к полиэтиленоксиду (б).

Аналогичный принцип регуляции стабильности мицелл под действием света применим также в случае отщепления хромофора, приводящего к необратимой диссоциации мицелл (Рис.13). Фотоиндуцированное отщепление может быть достигнуто в случае, если хромофор прикреплен к цепи

143

полимера через метил-эфирную группу [1096]. Такой эффект можно получить если гидрофобный хромофор, образованный производным пирена, или 2-нитробензола прикреплен к гидрофильной цепи полиэтиленоксида в результате чего образуются диблоксополимеры PEO-b-PPyMA или PEO- b-PNBMA [1085]. Особый интерес представляет фотолиз PEO-b-PNBMA, поскольку его можно активировать посредством двух-фотонного поглощения в ближней инфракрасной области (700 – 1000 нм). Как отмечалось ранее, такое излучение обладает существенно большей проникающей способностью, чем ультрафиолет. Эффективность двухфотонной реакции существенно ниже, чем однофотонной, и процесс диссоциации мицелл протекает медленнее. Однако для некоторых хромофоров, например, основанных на кумарине, двухфотонная реакция протекает существенно быстрее, поскольку поглощение этого хромофоров в двухфотонном ре-

жиме выше [1097,1098].

а)

б)

		CH3		УФ				CH3
CH2 CH2	O CH2	C			CH2	CH2	O CH2	C
PEO-B-PPyMA	x	C	y				x	C y
	O	O					HO	O
	CH2							CH OH
								2

				CH3		УФ					CH3
CH2	CH2	O	CH2	C				CH2	CH2	O CH2	C
						или ИК
		x		C y						x	C y
PEO-B-PNBMA			O	O	двухфотонный					HO	O
			CH2								COH
				NO2							NO

Рис.13. Фотоотщепление хромофора пирена от диблоксополимера PEO-b-PPyMA (а) или отщепление хромофора нитробензола от PEO-b-PNBMA (б).

Подобные полимеры способны образовывать также липосомальные структуры, образованные бислоем полимерных молекул, как это было показано на сополимере полиэтиленгликоля и гидрофобного хромофора малахитового зеленого [1099]. Под действием ультрафиолета происходит диссоциация бислойных везикул в результате изомеризации хромофора и образования заряженных групп. Процесс обратим, и в темноте структуры липосом формируются вновь.

Известно, что мицеллы диссоциируют при снижении концентрации сурфактанта ниже величины ККМ (критической концентрации мицелло-

144

образования), что приводит к высвобождению их содержимого. Нарушение стабильности мицелл наблюдается также при взаимодействии с компонентами жидкой среды организма. Очевидно, что образование поперечных сшивок между молекулами полимера может существенно повышать стабильность образуемых ими структур. Такие стабилизирующие сшивки могут образовываться, например, в смеси из двух диблокполимеров полиэтиленгликоля, один из которых содержит L-лактид, а другой – D-лактид [1100]. Поперечные сшивки могут образовываться в области гидрофильной оболочки или в гидрофобном ядре. Хотя такие сшивки полезны для стабилизации частиц в процессе транспорта веществ, впоследствии они создают препятствие для высвобождения этих веществ, поскольку эти процессы требуют дестабилизации и разрушения частиц. Для решения этой проблемы можно использовать молекулы, способные образовывать обратимые светозависимые поперечные сшивки. Например, сшивки между хромофорами, содержащими производные кумарина

(Рис.14).

Рис.14. Диблоксополимер, содержащий гидрофильный полиэтиленоксид (РЕО). В качестве гидрофобной хромофорной группы использовано производное кумарина, входящее в состав сополимера кумарин метакрилата и метилметакрилата – Р(СМА- со-ММА). Под действием ультрафиолетового облучения разной длины волны между хромофорами этого полимера могут многократно и обратимо образовываться и разрушаться поперечные сшивки, что сопровождается формированием и диссоциацией мицелл.

Мицеллы, образованные полимерами, содержащими кумарин, способны многократно формироваться и диссоциировать под действием ультрафиолетового облучения разной длины волны [1101]. Примеча-

145

тельно, что используя двухфотонное возбуждение можно регулировать поперечные сшивки полимеров с кумарином в области видимого света, что расширяет возможности их применения [1102]. Для образования светозависимых обратимых поперечных сшивок возможно использование также других хромофоров, например, антрацена [1103] или производных циннамона [1104].

4.3. рН-чувствительные наноконтейнеры

4.3.1. Величина рН в организме

Величина рН жидкостей тела человека и млекопитающих в норме может существенно варьировать в различных органах и тканях, а также в различных отделах цитоплазмы (Табл.2).

Таблица 2. Величины рН жидкостей тела человека в норме [1105-1108].

Источник жидкости	рН
Кровь	7,34 – 7,45
Цереброспинальная жидкость	7,3
Моча	6,0
Секрет поджелудочной железы	8,1
Желудочный сок	1 - 3
Цитоплазма	7,2
Митохондрии (матрикс)	7,5
Эндосомы	5,0 – 6,5
Лизосомы	4,5 – 5,0

Как следует из таблицы, для русла крови обычно характерна слабо щелочная среда. Однако рядом с очагами некоторых патологических процессов и, в частности, во внутреннем пространстве сò лидных опухолей наблюдается некоторое снижение рН до величин рН 6,5 – 7,2 [1109,1110]. Это снижение рН среды можно объяснить большей скоростью метаболизма клеток опухолей, приводящей к накоплению молочной кислоты и гидролизу АТФ в условиях гипоксии. Еще большее снижение рН наблюдается при эндоцитозе частиц в клетку и транспортировке в эндосомальный компартмент, где кислотность среды может достигать величин рН 5,0

– 6,5. Такие изменения кислотности могут быть использованы в качестве сигнала для рН-чувствительных наночастиц в число которых входят липосомы и мицеллы (Рис.15).

Присутствие на поверхности наночастиц рН чувствительных молекулярных устройств позволяет им распознавать изменения рН в заданном

146

диапазоне значений. Кроме того, благодаря наличию специализированных исполнительных молекулярных устройств, частицы могут изменять свои свойства. К числу таких изменений относятся высвобождение лекарственных веществ в непосредственной близости от очага воспаления, инфекции или канцерогенеза, или же адгезия частиц на поверхности клеток, проникновение в клетку и высвобождение лекарственных веществ или генетического материала в цитоплазму [1111,1112].

Рис.15. Проницаемые стенки сосудов опухоли позволяют наночастицам проникать в тело опухоли, где рН среды понижена. Это снижение рН можно использовать для инициации высвобождения лекарства (обозначены крестиками) из частиц в среду, омывающую клетки (а). Иная стратегия предполагает взаимодействие наночастиц с поверхностью клеток, эндоцитоз, проникновение в эндосомы, где величина рН ниже, чем в окружении клеток. Наночастицы могут реагировать на это изменение рН, высвобождая лекарство в цитоплазму. Дальнейшее перемещение наночастиц в лизосому может приводить к их биодеградации (б).

4.3.2. Механизмы рН-чувствительности

Липосомы, чувствительные к изменениям рН среды, были созданы в конце 70-х, начале 80-х годов прошлого века как средство, улучшающее доставку лекарственных веществ к опухолям. Их действие основано на протонировании заряженных групп амфифилов, происходящее при снижении рН среды до величины, соответствующей рКα указанной группы [1113]. Величины рКα различных, наиболее часто встречающихся заряженных групп, представлены ниже (Табл.3). Данные величины нельзя рассматривать, как универсальные для всех химических соединений, поскольку, находясь в составе различных молекул, указанные в таблице за-

147

пряженные группы могут подвергаться воздействию окружающих атомов, что может приводить к отклонению величин рКα.

В состав рН-чувствительных липосом наиболее часто входит DOPE, образующий гексагональную Н2 фазу при физиологических значениях температуры [1111,1114]. В смеси с умеренно кислыми амфифилами (Рис.16), такими как олеиновая кислота (ОА), или хемисукцинат холесте-

рина (CHEMS – cholesteryl hemisuccinate) DOPE может формировать бис-

лойную структуру и образовывать липосомы. Внутреннее пространство этих липосом может быть заполнено лекарственным веществом. Однако при снижении величины рН среды кислые амфифилы не способны поддерживать бислойную структуру DOPE, барьерные свойства липосом нарушаются, что приводит к высвобождению лекарственного вещества

[1115,1116].

Таблица 3. Величины рКα ионизированных групп в молекулах липидов [81,1117].

Ионизированная группа

Формула

Пример

рКα

Отрицательный заряд (анионные, кислотные группы)

Диссоциация первого

Фосфатидная ки-

2,1

протона фосфатной

слота

группы

Диссоциация второго

7,2

протона фосфатной

То же

группы

Фосфатидилхолин,

сфингомиелин,

Фосфатная группа с

фосфатидилэтано-

двумя эфирными связя-

ламин, фосфати-

2,1

ми

дилинозит, фосфа-

тидилсерин, фос-

фатидилглицерин

Карбоксильная группа

Фосфатидилсерин

2,2

Жирные кислоты

4,9

Первичный амин

Фосфатидилэтано-

10,4

–

ламин

10,6

Вторичный амин

CTAP, DOSPER,

10,7

–

DOSPA, DOGS

11,1

Третичный амин

DC-холестерин

9,7

–

10,8

Фосфатидилхолин,

Четвертичный амин

сфингомиелин,

13,9

DOTMA, DDAB

Примечания: 1. В таблице дана аббревиатура синтетических катионных липидов, которые рассматриваются в соответствующем разделе книги. 2. Обозначения заряда в молекулах весьма условно. Заряд присутствует при рН > рКα для отрицательно заряженных групп и при рН < рКα для положительно заряженных групп. Как следует из таблицы, четвертичные амины несут положительный заряд во всем диапазоне рН.

148

Указанные изменения можно объяснить тем, что нейтрализация отрицательного заряда полярной группы, вследствие протонирования при снижении величины рН среды, приводит к уменьшению размеров гидратной оболочки вокруг этой группы, и соответственно, к изменению формы молекулы липида. Так, в нейтральной среде молекула олеиновой кислоты (ОА) имеет форму перевернутого конуса, тогда как в кислой среде молекула приобретает цилиндрическую форму, а возможно, даже, коническую форму (Рис.17). Это приводит к изменению внутренней кривизны слоя. При этом происходит нарушение барьерных свойств мембраны и высвобождение лекарственного вещества, заключенного во внутреннем пространстве липосом. Действие ОА усиливается в присутствии холестерина, в то время как присутствие олигонуклеотидов способно снижать рНчувствительность липосом, содержащих ОА [1118].

Рис.16. рН-чувствительные липиды, используемые при создании липосом. OA – олеиновая кислота (oleic acid) [1118,1119]; DОSG – диолеоил сукцинилглицерин

(dioleoyl succinylglycerol) [1120-1122]; PDP-PEG-DOPE – сополимер, состоящий из PDP – пиридилдитиопропионата (pyridyldithiopropionate), PEG и DOPE [965]; C-DOPE

– н-цитраконил DOPE (N-citraconyl DOPE); CHEMS – хемисукцинат холестерина

(cholesteryl hemisuccinate) [905,1123]; CCTC - [(2-(Cholesteryloxycarbonyl-[2-(bis- carboxymethyl-carbamoyloxy)-ethyl]-amino)-ethoxycarbonyl)-carboxymethyl-amino]-acetic acid [1124].