3 курс / Фармакология / Интеллектуальные_липидные_наноконтейнеры_в_адресной_доставке_лекарственных

149

Рис.17. Изменение формы молекул и образуемого ими слоя липидов в средах различной кислотности. На рисунке показана типичная для рН-чувствительных липосом смесь липидов из DOPE и OA. В нейтральной среде (а) молекула ОА заряжена, имеет большую гидратную оболочку, что придает ей форму перевернутого конуса. Перевернутые конусы молекулы ОА совместно с коническими молекулами DOPE образуют плоские структуры, способные формировать бислойную мембрану. В кислой среде (б) происходит протонирование карбоксильной группы ОА, приводящее к компенсации отрицательного заряда и уменьшению размеров гидратной оболочки полярной головы молекулы. Вследствие этого молекула ОА приобретает цилиндрическую форму и, совместно с коническими молекулами DOPE, образует слои с большой отрицательной кривизной, что приводит к разрушению бислоя и образованию инвертированных фаз.

4.3.3. рН-чувствительные липосомы

Наиболее хорошо изучены рН-чувствительные липосомы, в которых использована смесь OA/DOPE. Указанная смесь липидов использовалась при создании первых рН-чувствительных липосом [1125-1127]. Однако при использовании ОА требуется довольно большое количество этого компонента (до 40 моль %), чтобы стабилизировать бислойную структуру. При этом барьерные свойства смеси DOPE:OA могут нарушаться уже при рН 6,5, что может приводить к высвобождению содержимого липосом вне клетки или на ранних стадиях эндоцитоза. Напротив, смеси DOPE:CHEMS обычно более стабильны и нарушение барьерных свойств мембран наступает при значениях рН 5,5, что соответствует условиям поздних стадий эндоцитоза [1111,1128]. Использование молекул, чувствительных к различным значениям рН [1128,1129] позволяет создавать липосомы, способные высвобождать лекарства в заданном диапазоне рН.

Дополнительное стабилизирующее влияние на липосомы может оказывать холестерин. В состав липосом могут входить также нейтральные липиды, например фосфатидилхолин, или отрицательно заряженные липиды, такие как фосфатидная кислота или фосфатидилсерин. Ответ на понижение рН среды может быть усилен добавлением таких молекул, как пептиды слияния [906], рН чувствительные полимеры, которые могут

150

быть прикреплены к поверхности липосом [1130-1132], или рН чувствительные липиды [905,1123]. Комбинирование указанных веществ позволяет более точно «настраивать» зависимость барьерных свойств липосом от величины рН.

Кроме изменения барьерных свойств, было обнаружено, что в кислой среде активируются процессы слияния рН-чувствительных липосом с различными мембранами, включая клеточные мембраны [1126,1133,1134] а также взаимодействие липосом с поверхностью клеток, приводящее к эндоцитозу. В результате эндоцитоза липосомы попадают вначале в эндосомальный, а в последствии, в лизосомальный компартменты клетки, где величина рН понижена, что способствует дестабилизации рНчувствительных липосом, инициирует процессы слияния липосом с окружающими их мембранами эндосом, что может способствовать высвобождению лекарственного содержимого в цитоплазму. Пути транспортировки липосом в цитоплазме хорошо прослежены. Этот процесс требует метаболической энергии и инактивируется веществами, способствующими повышению величины рН в поздних эндосомах и лизосомах, такими как хлорохин или моненсин [1127,1135]. Слиянию мембран может способствовать частичная дегидратация поверхности бислоя, связанная с нейтрализацией заряженных групп, а также появление дефектов бислоя, и формирование, так называемых, промежуточных структур слияния (интермедиатов слияния), возникающих в мембранах с большой отрицательной кривизной [505].

Хотя липосомы, содержащие рН-чувствительные молекулы, эффективны в доставке веществ в цитоплазму клеток культуры тканей, они недостаточно стабильны в плазме крови и быстро удаляются из кровяного русла при использовании in vivo [1111]. Для увеличения времени циркуляции рН-чувствительных липосом в крови в их состав вводят липиды, несущие полиэтиленгликоль (PEG). Однако PEG препятствует сближению мембран липосом с мембранами клетки и процессам их слияния, необходимым для высвобождения содержимого липосом в цитоплазму. Таким образом, эффективность рН-чувствительных липосом снижается, если они покрыты PEG [1111,1136,1137]. Для преодоления этого препятствия было предложено прикреплять PEG к липиду через тиольную группу, в результате чего молекула PEG может отделяться от поверхности липосом под действием тиолитических ферментов, присутствующих в эндосомальном

– лизосомальном компартментах. Другое решение предполагает прикрепление липидов к PEG через эфирную связь, которая может разрушаться в лизосомальном компартменте под действием эстераз [751]. Создатели таких комплексов предполагают, что, находясь в русле крови, липосомы стабилизируются с помощью PEG, но при попадании в клетку, PEG будет отделяется от поверхности липосом под действием соответствующих

151

ферментов, чтобы не препятствовать слиянию мембран и высвобождению лекарства в цитоплазму [1138].

К сожалению, исследования конъюгатов PEG с липидами, прикрепленными через дисульфидные мостики, показали низкую эффективность этой системы in vivo, поскольку дисульфидные группы расщеплялись уже при нахождении липосом в русле крови. Кроме того, такие липосомы не обладали достаточными барьерными свойствами, необходимыми для длительного удержания лекарства при циркуляции в крови [1139]. Эффективность конъюгатов на основе эфирной связи еще предстоит исследовать. Было предложено также прикреплять к поверхности липосом рНчувствительные пептиды, способные инициировать процессы слияния мембран в кислой среде. К числу таких пептидов относятся N-концевой пептид (INF пептид), полученный из гемагглютинина вируса гриппа [1140], пептиды GALA [1141], или листериолизин – пептид из бактерии Listeria monocytogenes, способный образовывать поры в бислое [1142]. Однако, клиническое применение липосом, содержащих полипептиды на поверхности, затрудняется их повышенной иммуногенностью [631,1142].

Синтетические полиэлектролиты также могут инициировать дестабилизацию липосом при изменении величины рН за счет фазового перехода клубок – глобула [1111,1142-1144]. Для создания рН-чувствительных липосом используются такие полимеры, как поли-(алкил-акриловые) кислоты [1145-1147], сукцинилированный этиленгликоль [1148] или полиглицидол [1131], биодеградируемые полифосфазены [1149], и сополимеры изопропилакриламида [1132,1143,1150,1151]. Так, было показано, что сополимеры, образованные алкилакрилатами и метакриловой кислотой, способны дестабилизировать липидный бислой вплоть до полного разрушения везикул и формирования мицелл [1144,1152,1153] и инициировать высвобождение их содержимого при снижении рН [1154,1155].

Производные полиглицидола способны придавать рНчувствительность липосомам из яичного фосфатидилхолина [1148,1156]. В частности, это было продемонстрировано в отношении SucPG. Этот полимер, сходный с полиэтиленгликолем, имеет многочисленные боковые карбоксильные группы (Рис.18 А).

При нейтральных рН полимер «заякоривается» в липидном бислое, что не препятствует формированию липосом, способных транспортировать лекарственные вещества. При снижении рН происходит существенная дестабилизация бислоя, что приводит к нарушению барьерных функций мембран и высвобождению содержимого липосом. Однако, в отличие от поли-алкил-акрилатов, которые полностью разрушают (солюбилизируют) бислойную структуру и инициируют формирование мицелл, SucPG инициирует слияние липосом [1148,1158], что, возможно, является более щадящим и эффективным механизмом доставки веществ в цитоплазму

152

А

Б

Рис.18. А - производные полиглицидола (PG – poly-glycidol). Показаны различные боковые группы: SucPG – сукцинилированный PG, GluPG – глютарилированный PG, MGluPG – 3-метилглютарилированный PG, CHexPG – 2-карбокси- циклогексанолированный PG [1157]. Кроме того, на рисунке изображено проникновение гидрофобной углеводородной цепи вглубь бислоя благодаря которому происходит « заякоривание» полимера на поверхности липосомы. Б – предполагаемый механизм воздействия производных полиглицидола на кривизну слоя липидов при изменении кислотности среды. В нейтральной среде полимер « заякорен» в бислое фосфолипидов (фосфатидилхолина), но заряженные боковые группы растворимы в воде и не взаимодействуют с фосфолипидами (а). При снижении рН отрицательно заряженные боковые группы протонируются, теряют заряд, становятся гидрофобными и « вклиниваются» между молекулами фосфолипида, что приводит к искривлению внешнего монослоя липидов и нарушению барьерных свойств липосом.

153

[1156]. Способность этих полимеров инициировать слияние мембран липосом с мембранами эндосом при снижении рН позволяет успешно использовать данные рН-чувствительные липосомы для доставки ДНК

[1159-1161].

Недавно было проведено сравнительное исследование различных производных полиглицидола, отличающихся по степени гидрофобности боковых цепей. Все исследованные полимеры (Рис.18 А) были водорастворимы в нейтральных рН, но теряли растворимость в воде в слабокислых средах [1157]. Этот эффект увеличивался в ряду: SucPG < GluPG < MGluPG < CHexPG, что коррелирует с числом углеродных атомов в боковой цепи полимера. Гидрофобность CHexPG была столь велика, что этот полимер дестабилизировал бислойную структуру даже в нейтральных рН, тогда как остальные полимеры обладали такой способностью только при подкислении среды, что позволяло создавать рН-чувствительные липосомы. Можно предположить, что при снижении величины рН происходит протонирование заряженных боковых групп, благодаря чему они приобретают гидрофобность и погружаются во внешний монослой липида, увеличивая кривизну мембраны и дестабилизируя бислой (Рис.18 Б).

При создании рН-чувствительных липосом часто используется сополимер н-изопропилакриламида (NIPAM - isopropylacrylamide) с небольшим количеством (менее 10 моль%) титруемой добавки, например, метакриловой кислоты (МАА – methacrylic acid). Цепочка сополимера NIPAM- co-MAA способна заякориваться в мембране липосом, если ее алкилировать на одном конце [1130]. При снижении рН окружающей среды происходит коллапс полимера, что изменяет внутреннюю кривизну мембраны и способствует возникновению дефектов бислоя [1150,1151,1162,1163]. Этот механизм может функционировать также к клетке, способствуя высвобождению содержимого липосом в цитоплазму [1132,1162]. Комбинирование алкилированного NIPAM с PEGмодифицированным липидом позволяет создавать липосомы, одновременно чувствительные к изменению рН и способные к длительной цирку-

ляции в крови [1164,1165].

4.3.4. рН-чувствительные мицеллы

Существенный прогресс был достигнут также при создании рНчувствительных полимерных мицелл. В этой области имеется ряд остроумных разработок. Так, были созданы рН-чувствительные полимерные мицеллы для доставки доксорубицина к раковым клеткам на основе сополимеризации PEG с полигистидином [1166]. В состав мицелл входили 75 весовых процентов сополимера полигистидин-полиэтиленгликоль, а также 25 весовых процентов поли-L-молочной кислоты. Дестабилизация мицелл наблюдалась при снижении рН до 6,8, что соответствует среде, ок-

154

ружающей некоторые сò лидные опухоли. На поверхности мицелл содержались также молекулы фолиевой кислоты для обеспечения специфического взаимодействия мицелл с фолат-рецепторами на поверхности раковых клеток. Было показано, что такие мицеллы обладали высокой цитотоксичностью не только in vitro, но также in vivo [1167,1168]. Предполагается, что после взаимодействия с рецепторами фолата на поверхности клеток, мицеллы эндоцитируются клеткой, а после снижения рН в эндосомах, они способны высвобождать лекарственное вещество в цитоплазму [1169]. Для преодоления некоторых технических трудностей в хранении и использовании этих мицелл недавно была разработана и опробована методика их лиофилизации [1170].

Частицы, обладающие рН чувствительностью могут использоваться также при пероральной доставке веществ в том случае, если необходимо высвобождение лекарственного вещества в желудке, при низких значениях рН, или наоборот, лекарственное вещество должно быть защищено от агрессивного действия желудочного сока и его высвобождение предполагается при достижении слабо щелочной среды кишечника. Так, для увеличения эффективности доставки витамина В12 были разработаны части-

цы на основе блоксополимеров: poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-methyl methacrylate) (poly (NIPAAm-co-MA-co-MM)), а также poly

(N-isopropylacrylamide-co-acrylamide) (poly (NIPAAm-co-AAm)) [1171].

Благодаря присутствию в их составе термочувствительного полимера NIPAAm частицы обладали также термочувствительностью и высвобождали лекарство только при ³ 37 ºС. В кислых средах (рН 1,2) они образовывали нерастворимый гель, тогда как в нейтральных средах (рН 6,8 – 7,4) и при температуре тела происходило растворение полимера и высвобождение лекарства. При более низких температурах лекарственное вещество могло длительное время сохраняться внутри частиц при нейтральных значениях рН.

4.3.5. Доставка веществ в цитоплазму

Использование ТАТ-пептида позволяет существенно повысить эффективность доставки веществ в цитоплазму и клеточное ядро. Хотя механизм этого явления пока недостаточно изучен, некоторые исследователи полагают, что ТАТ-пептиды позволяют транспортировать вещества из клеточной периферии к ядру [1172,1173]. При этом, пути проникновения частиц в клетку с участием ТАТ-пептидов могут зависеть от размера частиц [1174]. Недостатком использования этого класса пептидов является отсутствие специфичности, поскольку они могут с одинаковой эффективностью проникать как в раковые, так и в здоровые клетки. Для обеспечения такой специфичности можно использовать снижение величины рН в

155

А

Б

Рис.19. рН-зависимое экспонирование ТАТ-пептида на поверхности мицеллярных наночастиц, образованных сополимеризацией молочной кислоты и полиэтиленгликоля. А – наночастицы окружены оболочкой PEG. Некоторые молекулы PEG несут ТАТ-пептид, обладающий положительным зарядом (как обозначено на схеме) и способствующий проникновению наночастиц в клетку. В нейтральной среде ТАТ-пептид спрятан благодаря электростатическому взаимодействию с рН-чувствительным полимером PCBS-b-PEG, несущем отрицательный заряд. Находящийся на поверхности PEG создает условия для длительной циркуляции частиц в крови. При снижении рН отрицательно заряженные группы полимера протонируются, заряд нейтрализуется, что приводит к экспонированию ТАТ-пептида на поверхности частиц. Б – структурная формула рН-чувствительного полимера PCBS-b-PEG. Боковая группы, представленные сульфонамидом, несут отрицательный заряд в нейтральной среде, но при снижении рН заряд компенсируется протонами. Благодаря этому сульфонамид определяет чувствительность полимера к изменениям рН. Наличие дисульфидного мостика (- S – S -) в цепи полимера определяет его способность к биодеградации под действием глютатиона цитоплазмы.

156

окружении клеток твердых опухолей [1109,1110]. Хотя, наблюдаемое в опухолях, понижение рН незначительно, создан ряд полимерных частиц, способных его использовать для доставки веществ [1112,1167,1175,1176]. Наиболее чувствительными к изменениям рН в необходимом диапазоне значений обладают сульфонамидные группы [1172,1177]. Недавно были создана «умная» наноплатформа на основе полимерных мицелл диаметром 20 – 45 нм [1178], в которой наночастицы могут скрывать ТАТпептид при движении в русле крови, но экспонировать его на поверхности при попадании в опухоль, где рН снижается до значений 6,0 – 6,5 ( Рис.19 А). Присутствие ТАТ-пептида на поверхности частиц способствует их проникновению в цитоплазму. Недостатком указанной платформы было отсутствие способности полимеров к биодеградации, что было исправлено в следующей работе [1176], где был представлен биодеградируемый рН-чувствительный диблок сополимер PCBS-b-PEG, способный взаимодействовать с ТАТ-пептидом благодаря наличию отрицательного заряда при нейтральных рН (Рис.19 Б).

В этой же лаборатории недавно был разработан иной способ рНзависимого экспонирования ТАТ-пептида на поверхности наночастиц [1179,1180]. Эта стратегия получила название «подскок» или «попап» (английское pop-up означает неожиданное появление чего-либо). Попапмицеллы были созданы из смеси двух блок-сополимеров. Первый блоксополимер был образован полилактатом и полигистидином и участвовал в формировании ядра мицеллы.

Рис.20. рН-зависимые изменения структуры попап-мицелл. В нейтральной среде положительно заряженный блок полигистидина и функциональной группы (ТАТпептид или фолиевая кислота) прячется внутри оболочки из PEG (а). В таком состоянии мицеллы могут длительное время циркулировать в крови и накапливаться в опухоли. При снижении рН, характерном для окружения некоторых опухолей, взаимодействие положительно заряженного блока полигистидина с ядром мицеллы ослабевает, в результате чего функциональная группа « подскакивает» на поверхность мицелл (б), что способствует проникновению мицелл в клетку. При дальнейшем снижении рН, которое наблюдается в поздних эндосомах или лизосомах, происходит разрушение мицелл и высвобождение лекарственного вещества в цитоплазму

(в).

157

Второй блок-сополимер имел более сложную структуру: [poly(L- lactic acid)-b-poly(ethylene glycol)-b-poly(l-histidine)-TAT ]. В соответствии с указанной формулой полимер содержал полилактат, образующий ядро мицеллы, к которому были последовательно прикреплены PEG, образующий гибкую связующую цепь, далее – полигистидин, образующий блок с большим положительным зарядом. На конце цепи находилась функциональная группа, ответственная за взаимодействие мицелл с клеткой и проникновение в цитоплазму. В качестве такой группы авторы использовали фолиевую кислоту или ТАТ-пептид (Рис.20). Было показано, что при нейтральных или слабо щелочных рН, характерных для большей части кровяного русла, функциональная группа прячется под поверхностью оболочки, образованной нитями полиэтиленгликоля, что благоприятствует длительной циркуляции мицелл в крови.

Благодаря эффекту ППУ наночастицы имеют тенденцию накапливаться в опухолях или рядом с центрами воспалительных процессов, где величина рН несколько ниже, чем в крови. Даже незначительное снижение рН до величин 7,2 – 6,5 приводит к изменению величин зарядов полилактата и полигистидина, что ослабляет связь полигистидина с ядром и обеспечивает «подскок» функциональной группы на поверхность мицеллы. Взаимодействие функциональной группы (ТАТ-пептида) с поверхностью клетки инициирует процессы эндоцитоза наночастиц, в результате чего они попадают в эндосомальный компартмент, где наблюдается постепенное снижение величины рН по мере транспортировки эндосом вглубь цитоплазмы. При дальнейшем подкислении среды до значений рН < 6,5 происходит более полная нейтрализация заряда полилактата, и имидазольного кольца гистидина, что приводит к разрушению мицелл [1181] и высвобождению лекарства в цитоплазму [1169,1179,1180].

4.4. Термочувствительные наноконтейнеры

Термочувствительные системы являются одними из наиболее широко разрабатываемых средств доставки лекарственных веществ. В этой области существенный прогресс достигнут в создании термочувствительных полимеров, которые используются при создании термочувствительных устройств различных размеров, включая наночастицы, мицеллы и липосомы. Хорошо известно также, что некоторые липиды, входящие в состав липосом, также обладают выраженной способностью к структурным перестройкам в ответ на изменения температуры. Липосомы, содержащие такие липиды, можно успешно использовать для высвобождения веществ, заключенных в их внутреннем пространстве. Термочувствительные липосомы можно разделить на две большие группы: липосомы, содержащие термочувствительные липиды, и липосомы, модификация которых произ-

158

водится посредством термочувствительных полимеров, находящихся на поверхности липосом [1182].

4.4.1. Термочувствительные липиды

Способность липосом высвобождать лекарственные вещества под действием температуры впервые была описана более 30 лет назад [1183]. Эти липосомы принадлежали к первому типу, поскольку содержали термочувствительные липиды. Механизм их действия был основан на дестабилизации липидного бислоя, происходящей при температуре плавления липида (Tm) [1184]. Для этих целей авторы использовали смесь из дипальмитоил фосфатидилхолина (DPPC, Tm = 41,4 ºС) и дистеароил фосфатидилхолина (DSPC, Tm = 54,9 ºС). Высвобождение лекарства из липосом наблюдалось при повышении температуры > 43 ºС. Добавление лизолипида (1-пальмитоил-2-лизо-фосфатидилхолина) позволяло снизить рабочую температуру устройства до клинически более обоснованной (39,5 – 41,5 ºС). Это позволило также увеличить скорость выхода содержимого. Так, было показано, что доксорубицин способен полностью высвобождаться из таких липосом в течение 20 сек [1185]. На основе этих исследований фирмой Celsion был разработан липосомальный препарат ThermoDox® , который в 2008 г. успешно прошел первую фазу клинических испытаний на больных с раком печени, а в 2009 г. – на больных раком молочной железы.

Кроме того, был создан новый термочувствительный фосфолипид DPPGOG (Рис. 21) [1186]. В смеси с DPPC и DSPC авторам удалось получить термочувствительные липосомы, диаметром 175 нм, способные высвобождать доксорубицин при температуре 41 – 42 º С, тогда как при температуре тела липосомы были довольно стабильны с полупериодом высвобождения лекарства 5 – 10 часов.

Недавно для создания термочувствительных липосом был предложен иной класс веществ, алкилфосфохолины (APC – alkylphosphocholines), которые предполагается использовать для доставки лекарств в противораковой терапии [1187]. В отличии от лизофосфолипидов, молекулы APC не содержат остатков глицерина, при этом алкильная цепь непосредственно прикрепляется к фосфохолину посредством эфирной связи. В отличие от лизофосфолипидов APC медленнее биодеградируют [1188] и накапливаются в тканях опухоли, проявляя выраженную антинеопластическую активность [1189].

Хотя механизм действия АРС не до конца понятен, известно, что они накапливаются в липидном бислое мембран и могут влиять на сигнальную систему клеток. Была отмечена способность раковых, но не здоровых, клеток захватывать эти липиды, что приводило к активации системы