3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

ДОПОЛНЕНИЕ 4

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИЗУЧЕНИЮ ОБЩЕТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ

ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ, ПРЕДЛАГАЕМЫХ ДЛЯ ПЕДИАТРИЧЕСКОЙ ПРАКТИКИ

СОСТАВИТЕЛИ: член-корр. РАМН, проф. Т.А. Гуськова; д. м. н., проф. Е.В. Арзамасцев; к. б. н. В.В. Бортникова; к. б. н. Г.Н. Енгалычева; к. б. н. Л.В. Крепкова; к. м. н. Р.Д. Сюбаев

Введение

Каждый возрастной период человека характеризуется определенным функциональным состоянием органов и систем организма, что не может не влиять на их чувствительность к экзогенным веществам, в том числе и ЛП. Развивающийся организм человека и животных значительно отличается от взрослого организма незрелостью строения и функционирования многих органов и систем, продолжающимся их формированием и неодновременным созреванием, несовершенными биохимическими и физиологическими процессами, меньшей активностью биотрансформирующих ферментов печени и экскретирующей функции почек, которые могут существенно изменять фармакокинетику и фармакодинамику ЛС и, следовательно, специфическую эффективность и токсичность. Особое значение при этом имеет сочетанное применение нескольких препаратов [1–6].

1. Общие положения

Применение ряда ЛС в педиатрии запрещено или ограничено в связи с высоким риском тяжелых, часто специфических для детского возраста побочных эффектов. Все это свидетельствует о необходимости особого отношения к доклинической оценке безопасности ЛП для педиатрии.

В настоящее время развивающиеся («ювенильные») животные признаны стандартным объектом в токсикологических исследованиях ЛП для педиатрической практики. Использование развивающихся животных в качестве исследовательской тест-системы позволяет моделировать разные онтогенетические периоды развития организма. Это позволяет проводить адекватную оценку безопасности применения ЛП в конкретной возрастной группе пациентов (новорожденных, детей, подростков).

Международная практика разработки ЛС имеет отчетливую тенденцию к оптимизации доклинической программы исследований за счет исключения малоинформативных экспериментов на животных и поэтапного выполнения токсикологических исследований с учетом фазы КИ. В связи с этим в настоящие рекомендации включены положения, отражающие зарубежный опыт и методологические подходы, содержащиеся в официальных документах национального и международного статуса [7–11].

Доклинические исследования проводятся в соответствии с существующими правилами лабораторной практики, утвержденными уполномоченным федеральным органом исполнительной власти РФ (Приказ Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г.

№708н «Об утверждении правил лабораторной практики»).

2.Планирование исследований на развивающихся (ювенильных) животных

Основная цель доклинической оценки безопасности препаратов, предназначенных для применения в педиатрии, должна быть сфокусирована на выявлении их нежелатель-

41

ного воздействия на процессы роста и развития, а также различий в чувствительности между взрослыми и ювенильными животными. Биомаркеры нежелательных эффектов, установленных в токсикологических исследованиях, необходимо использовать для мониторинга состояния пациентов в КИ.

Стратегия проведения токсикологических исследований зависит от схемы применения препарата в педиатрии, а также от объема и характера имеющейся информации о его безопасности при использовании у взрослых.

Всоответствии с международными рекомендациями, до начала КИ с участием детей должны быть получены результаты исследований хронической токсичности соответствующей продолжительности на взрослых животных, фармакологических исследований безопасности и генотоксичности в стандартной батарее тестов. Исследования репродуктивной токсичности (фертильности, пре- и постнатального развития) особенно важны для оценки риска прямого токсического действия и влияния на развитие. Исследования канцерогенности обычно не требуются для проведения КИ ЛС, за исключением тех случаев, когда имеется существенные основания (например, доказанные генотоксические эффекты или наличие проканцерогенного риска) [11].

Всоответствии с Законодательством РФ, КИ с участием детей можно проводить только после того, как препарат будет зарегистрирован для применения у взрослых.

Для интерпретации результатов токсикологических исследований на ювенильных животных в зарубежных руководствах применяется следующая классификация возрастных групп педиатрических пациентов [10]:

1. Недоношенные новорожденные.

2. Новорожденные от 0 до 27 дней.

3. Младенцы от 28 дней до 23 месяцев.

4. Дети (от 2 до 11 лет).

5. Подростки (от 12 до 18 лет).

Основным критерием адекватности исследований на ювенильных животных является соответствие их постнатального периода развития возрастным характеристикам развития пациентов в целом, а также конкретным системам, которые определяются как конечные точки токсического действия (органы-мишени). Ткани, подверженные значительному постнатальному развитию могут иметь более высокую чувствительность к определенным токсическим воздействиям, чем зрелые ткани. Органные системы, определяемые как подверженные значительному постнатальному росту и развитию, включают нервную, репродуктивную, легочную, почечную, скелетную, желудочно-кишечную, гепатобилиарную и иммунную системы.

Принципиальное значение имеет оценка обратимости эффектов и достаточный период отсроченного наблюдения для определения результата токсического воздействия препарата на морфологические и функциональные характеристики развивающихся систем

кмоменту их онтогенетической зрелости.

Возрастные характеристики ювенильных животных и человека с учетом периода онтогенетического развития нервной, репродуктивной, скелетной, легочной, иммунной, мочевыделительной, сердечной и метаболической систем представлены в таблицах 1–10.

Исследованию подвергаются субстанции фармакологических веществ, при введении их в желудок или парентерально, которые проводят чаще всего на крысятахотъемышах. Для токсикологического изучения детских лекарственных форм используют крольчат или щенят. Крольчата больше подходят для изучения мягких лекарственных форм (кремы, мази, гели, суппозитории и т.д.); щенята — для изучения лекарственных форм, предназначенных для приема внутрь (таблетки, капсулы, порошки, сиропы).

42

3.Особенности оценки острой токсичности лекарственных средств для педиатрии

3.1. Вид лабораторных животных

Для оценки токсичности ЛП, предназначенных для детей раннего возраста, необходимо провести исследования на тех видах животных, на которых возможно введение веществ в более ранние периоды развития. В зависимости от цели исследования выбирают необходимый вид животного, чаще всего исследования выполняют на крысятах или мышатах, в том числе новорожденных.

3.2.Пути и объемы введения

Умелких лабораторных животных острую токсичность фармакологического вещества исследуют при двух способах введения (энтеральном и парентеральном), один их которых соответствует способу применения в клинике. Для крысят (мышат) в ранние сроки постнатального периода предпочтительнее внутрибрюшинное введение вещества. Фармакологические вещества, предлагаемые для приема внутрь, следует вводить через зонд. Объем вводимого раствора животным разного возраста должен быть одинаковым на единицу массы тела. Так, крысятам следует вводить 0,01 (не более 0,02) мл на 5 г массы тела, тогда как животному с массой тела 100 г — 0,2 (0,4) мл раствора той же концентрации. Введение больших объемов растворов неполовозрелым животным не рекомендуется из-за возможного увеличения объема циркулирующей крови, содержания жидкости в организме и нагрузки на сердечно-сосудистую систему (ССС).

Процедура оценки острой токсичности, а также рекомендуемая форма представления результатов не отличается от типичных, описанных в базовом документе «Методические рекомендации по изучению общетоксического действия ЛС».

4.Особенности оценки хронической,

субхронической (подострой) токсичности лекарственных средств для педиатрии

В эксперименте используют детенышей, отсаженных от матери, возраст которых составляет: для крысят — 25–30 дней, мышат — 21 день, крольчат 40–45 дней, щенят 60– 75 дней.

Для оценки токсичности фармакологических веществ в условиях субхронического эксперимента формируют группы из 10–15 детенышей из разных пометов. В качестве контроля обязательно используют животных того же возраста, находящихся в аналогичных условиях, получающих плацебо.

Препараты начинают вводить детенышам сразу после отсаживания их от матери. Длительность введения препаратов щенятам при изучении субхронической токсич-

ности должна составлять 35–40 дней, а при изучении хронической токсичности — 6 месяцев. Для изучения субхронической токсичности на крысятах и крольчатах оптимальной является длительность 30–45 дней с еженедельной оценкой основных интегральных показателей, ежемесячным исследованием периферической крови и функциональным состоянием основных органов и систем организма. В конце хронического эксперимента проводятся патогистологические исследования внутренних органов животных. Эвтаназия должна проводиться в соответствии с этическими нормами обращения с животными.

Фармакологические вещества, предлагаемые для приема внутрь, следует вводить через металлический зонд (мышата, крысята), закладывать на корень языка или вводить через мягкий зонд (щенята, крольчата). Щенята могут получать препараты с кормом только при индивидуальном содержании, чтобы была уверенность, что вся доза препарата поступила в организм животного.

Фармакологические вещества, предлагаемые для местного применения, наносят или вводят в соответствующую область тела, согласно способу, предлагаемому для клиники.

43

Инъекционные ЛС, предназначенные для внутривенного введения, исследуют на крольчатах или щенятах при указанном способе введения или крысятах при внутрибрюшинном введении.

Выбор экспериментальных доз при проведении токсикологических исследований на развивающихся животных основывается на показателях среднесмертельных доз (ЛД50), полученных при однократном введении препарата, и терапевтической дозы, указанной в инструкции по медицинскому применению. Как правило, фармакологические вещества испытываются в 2–3 дозах, максимальная из которых сопоставляется с ЛД50 (1/10, 1/20 ЛД50) при соответствующем способе введения и ограничивается физиологически допустимым объемом введения.

Длительность введения препаратов растущим лабораторным животным составляет 1–2 месяца или до наступления половозрелости с еженедельной оценкой основных интегральных показателей, ежемесячным исследованием периферической крови и функционального состояния основных органов и систем организма. В конце хронического эксперимента проводятся патогистологические исследования внутренних органов животных.

Основные параметры и процедуры оценки хронической токсичности, а также рекомендуемая форма представления результатов не отличаются от типичных, описанных в базовом документе «Методические рекомендации по изучению общетоксического действия ЛС». Следует отметить, что особое внимание должно быть уделено системам, которые в большей степени подвержены изменениям в различные возрастные периоды.

5. Особенности токсикологического изучения лекарственных средств на новорожденных животных

Особое внимание необходимо уделить изучению безопасности ЛС, предназначенных для применения у новорожденных и недоношенных детей. Незрелость систем детского организма (разная скорость всасывания лекарственных веществ из желудочнокишечного тракта (ЖКТ), повышенная проницаемость гемато-энцефалического барьера в первые 2—3 недели жизни, меньшая активность биотрансформирующих ферментов печени и экскретирующей функции почек) может привести к изменению кинетики, метаболизма ЛС и взаимодействия их с рецепторами.

У детей первого года жизни и особенно периода новорожденности всасывание ЛС из пищеварительного тракта происходит медленнее, чем в старшем возрасте. Это связано с медленным продвижением и перемешиванием пищи в желудке и кишечнике, незрелостью механизмов активного транспорта через стенку кишечника, их легкой повреждаемостью при нарушениях гемодинамики и гомеостаза. Кормление детей молоком может оказать существенное влияние на активность и токсичность препаратов, применяемых внутрь. Хорошо известно, что всасывание жира в кишечнике новорожденных ограничено функциональными возможностями самого кишечника и поджелудочной железы.

Все вышеизложенное объясняет необходимость проведения токсикологических исследований фармакологических веществ, предназначенных для применения у новорожденных и недоношенных детей, на новорожденных животных.

Для парентеральных способов введения препаратов, особенно обладающих раздражающим действием, необходимо учитывать возможное отсутствие у животных раннего возраста истинной воспалительной реакции как в ЖКТ, так и в подкожной клетчатке. Незрелость барьеров создает условия для превалирования резорбтивного действия над местным. В связи с этим ЛД50 некоторых веществ может существенно не отличаться при внутрибрюшинном и подкожном введении.

5.1. Выбор и содержание животных, подбор в экспериментальные группы

В эксперименте используют крысят 2–3 дневного возраста. Самки с крысятами содержатся в индивидуальных клетках со свободным доступом к пище и воде. Параметры

44

окружающей среды должны соответствовать санитарно-гигиеническим нормам, установленным для биоклиник (вивариев).

Подбор животных в экспериментальные группы осуществляется с учетом количества родившихся крысят, оставляя при этом не более 8 новорожденных в помете (желательно одинаковое количество самцов и самок). Каждую экспериментальную группу составляют не менее 3–4 пометов. Каждый помет делят на 3 части (примерно 3:3:2). Поскольку новорожденные мышата и крысята не имеют шерстного покрова, их нельзя метить краской, которая удаляется при уходе матери за пометом.

Важнейшим моментом при проведении манипуляций с новорожденными и сосунками является риск их гибели после возвращения в гнездо вследствие отказа матери от ухода за детенышем и причинения ему вреда. Крысят из гнезда обязательно берут в перчатках, проводят соответствующие манипуляции и отсаживают от матерей на некоторое время (не более 30 мин) в специально подготовленную теплую емкость, затем возвращают в гнездо.

5.2. Способ и длительность введения

Способ введения препарата, как правило, должен соответствовать рекомендуемому способу применения в клинике. При технической трудности выполнения рекомендуемого способа в эксперименте на новорожденных животных могут быть использованы альтернативные способы (например, внутрибрюшинный). Следует учитывать высокую системную экспозицию наружных лекарственных форм, обусловленную анатомо-физиологическими особенностями барьерной функции кожи у новорожденных, особенно недоношенных (тонкость рогового слоя, обильное кровоснабжение, слабовыраженный подкожный жировой слой). Длительность введения препарата новорожденным, как правило, не превышает 4 недели. Последующий период наблюдения должен обеспечивать адекватную оценку конечных точек токсикологического воздействия.

(Подбор доз для новорожденных ничем не отличается от того, что уже описано выше).

Примерная программа токсикологического изучения фармакологического вещества на новорожденных крысятах:

1.Отобрать беременных самок с конкретным сроком беременности и получить потомство с одинаковым сроком рождения.

2.На первом этапе эксперимента необходимо определить острую токсичность фармакологического вещества при внутрибрюшинном способе введения общепринятыми в токсикологическом эксперименте методами, используя новорожденных крысят из разных пометов на каждую экспериментальную дозу.

3.Второй этап исследований включает изучение токсичности фармакологического вещества в условиях длительного введения новорожденным крысятам (3–4 недели). Для этого необходимо сформировать экспериментальные группы новорожденных крысят, каждая из которых должна состоять из 3–4 пометов с численностью не менее 10 крысят

вгруппе. При этом оценивается физическое развитие и поведение крысят, а в конце эксперимента проводятся гематологические, биохимические и патогистологические исследования и оценка влияния фармакологических веществ на функциональное состояние ЦНС. В случае необходимости исследования динамики гематологических, биохимических и других параметров следует увеличивать количество животных в группах (так как при взятии крови используют декапитацию животных).

Процедура оценки острой и субхронической токсичности, а также рекомендуемая форма представления результатов не отличается от типичных, описанных в базовом документе «Методические рекомендации по изучению общетоксического действия ЛС».

Интерпретация результатов исследования включает выводы о возможном влиянии препарата на процессы роста и развития, а также анализ различий его токсического действия у ювенильных и взрослых животных.

45

Заключение должно содержать обоснованное мнение авторов о возможности КИ изученного ЛС у детей конкретной возрастной группы (в том числе степень опасности острого и хронического отравления, прогноз возможных побочных реакций, рекомендации по мониторингу и минимизации риска неблагоприятных реакций).

Оформление отчета по доклиническому изучению общетоксического действия фармакологических средств для педиатрии проводится в соответствии с базовым документом.

		Таблица 1
Эквиваленты возраста белых крыс (самцов) и человека
(мужчин) по величинам истинной скорости роста массы тела
Период жизни крыс	Возраст крыс в месяцах	Возраст человека в годах
Ранний молочный	0,25	0,35
Средний молочный	0,5	1,56
Поздний молочный	1,0	4,80
Предпубертатный I	2,0	10,24
Предпубертатный II	3,0	14,20
Пубертатный	4,0	17,39
Репродуктивный	5,0	20,08
	6,0	22,32
	7,0	24,63

					Таблица 2
Периодизация неполовозрелого возраста животных различных видов
		Период молочного кормления
Вид	1. Возраст		Масса тела	2. Возраст
животных	новорожденный			подсосный	Масса тела
	(в днях)		(в г)	(в днях)
Собаки	1–14		400–1000	15–45	1,0–2,5 кг
Кролики	1–7		50–90	8–30	90–450 г
Морские свинки	1		60–85	2–21	80–150 г
Белые мыши	1–5		1–3,8	6–21	3,8–8,8 г
Белые крысы	1–5		4–6	6–21	11–35 г
		Период полового созревания
Вид
	3. Возраст			4. Возраст
животных	неполовозрелый		Масса тела	предслучный	Масса тела
	(инфантильный)			(ювенильный)
Собаки	2–5 мес.		2,6–12 кг	6–8 мес.	12–18 кг
Кролики	31–90 дн.		0,46–1,6 кг	4–6 мес.	1,4–2,5 кг
Морские свинки	31–91 дн.		0,35–0,46 кг	51–151 дн.	0,35–0,65 кг
Белые мыши	22–40 дн.		8,5–14,5 г	41–60 дн.	13,5–21 г
Белые крысы	22–50 дн.		30–110 г	51–120 дн.	90–270 г

46

	Нервная система				Таблица 3
		Период постнатального развития
Параметр развития
	Человек		Приматы	Собака	Крыса
	(годы)		(недели)	(недели)	(дни)
Глютаматные рецеп-	1–2 Кора				28
торы (максимальное	Снижение				Снижение
связывание)	у взрослых 2–16				у взрослых >28
Моноаминная система	2–4				21–30
					Уровень взрослых
Глазные функции	0–3				21–15
Мозжечковый наруж-	0,6–2				0–21
ный зародышевый слой
Окончание быстрой	2				25–30
фазы миелинизации
Умственное развитие	1–2		9–36	12–16	10–35
Замедленная реакция
на обучение

	Репродуктивная система				Таблица 4
		Период постнатального развития
Параметр развития
	Человек	Макака резус	Собака	Мышь	Крыса
	(годы)	(годы)	(дни)	(дни)	(дни)
Половая зрелость	11–12	2,5–3	180–240	15–45	40–60

		Скелетная система				Таблица 5
Параметр развития		Период постнатального развития
Слияние центров	Человек	Обезьяна	Собака	Кролик	Крыса	Мышь
оссификации	(годы)	(годы)	(годы)	(недели)	(недели)	(мыши)
Дистальный эпифиз	14–19	3–6	0,7–0,9	32	15–162	12–13
бедренной кости

	Легочная система				Таблица 6
Параметр развития	Период постнатального развития
			(дни)
Формирование альвеол	Человек		Крыса		Мышь
Начало	Пренатально		1–4		1–2
Завершение	730		28		28

47

Иммунная система		Таблица 7
	Период постнатального развития
Параметр развития		(дни)
	Человек	Мышь
Развитие В-клеток	Пренатально	Пренатально
Развитие Т-клеток	Пренатально	Пренатально
Развитие NK-клеток	Пренатально	21
Т-зависимый иммунный ответ	0	14
		41–56 уровень взрослых
Т-независимый иммунный ответ	45–90	0
		14–21 уровень взрослых
IgG уровень взрослых	1825	42–56

Почки (функция)			Таблица 8а
	Период постнатального развития
Параметр развития		(дни)
	Человек		Крыса
Гломеруло-/Нефрогенез	Пренатально		8–14
СГФ и канальцевая секреция уровень взрослых	45–180		15–21

		Почки (морфология)					Таблица 8б
Параметр			Период постнатального развития
развития				(недели)
	Человек		Собака	Кролик		Мышь	Свинья
Завершение	Пренатально		2	2–3		Пренатально	3
нефрогенеза	на 35 неделе

	Метаболизм		Таблица 9
	Развитие I/II фазы метаболизма
	Созревание активности ферментов
Фермент	Человек (годы)	Крыса (дни)	Кролик (дни)
CYP2D6	0–3	Нет данных	Нет данных
CYP2E1	0–1	4–17	14–35
		Снижение	2-кратный
		у отъемышей	уровень взрослого
		(самцы>самки)
CYP1A2	0,5	7–100 низкие уровни	21–60
	1 (> взрослых)
CYP2C8	<1	Нет данных	Нет данных
CYP2C9	<0,5	Нет данных	Нет данных
	0,5 (> взрослых)

48

		Развитие I/II фазы метаболизма
		Созревание активности ферментов
CYP3A4		0–2		Нет данных		Нет данных
Ацетилирование		1		Нет данных		Нет данных
		(35% взрослых)
Метилирование		<1		Нет данных		Нет данных
		(50% уровня взрослых)
Глюкуронирование		0 (> взрослых)				Нет данных
		12
Сульфатирование		0		Нет данных		Нет данных
		Сердце				Таблица 10
Параметр		Период постнатального развития
		(уровень зрелости, соответствующий взрослому)
развития
		Человек (годы)		Собака		Крыса (недели)
Электрофизиоло-		5–7		Нет данных		3–8
гия (ЭКГ)
Сердечный выброс		При рождении 138 уд/мин		Увеличение	Раннее увеличение
и гемодинамика		Взрослые 85 уд/мин		АД и снижение	ЧСС до постоянного
		<2 лет: меньший желудочко-		ЧСС от 1 неде-	у взрослых
		вый объем, ударный индекс,		ли до 0,5 года	Высокий сердечный
		фракция выброса в сравне-			выброс и легочное
		нии со взрослыми			сосудистое сопро-
		При рождении АД 62/40; 2			тивление
		месяца 85/47; 0,5-8 лет диа-
		столическое давление 58–62
Миоциты		Диплоидные при рожде-		Нет данных	Изначально дипло-
		нии по сравнению с 60% у			идные у детенышей
		взрослых (40% полиплоид-			и взрослых
		ные)
Коронарные		Диаметр артерий удваива-		Капиллярный	Капиллярный
сосуды		ется к 1 году, максимальный		ангиогенез	ангиогенез появля-
		к 30 годам. Капиллярный		появляется	ется постнатально,
		ангиогенез появляется		постнатально,	созревание артерий
		постнатально, снижается с		снижается с	к 1 мес.
		возрастом		возрастом
Сердечная		Количество нейронов		Развитие про-	Адренергические
иннервация		увеличивается и достигает		должается в	структуры созре-
		взрослого уровня в детстве		течение 2–4 ме-	вают к 3 нед.
				сяцев	Нервы — к 5 нед.
					Холинергические
					структуры созрева-
					ют постнатально

Литература

1.Бортникова В.В., Крепкова Л.В., Арзамасцев Е.В., Шкаренков А.А. Методические подходы к доклиническому изучению безопасности лекарственных средств для применения в педиатрии Мат. IV Междунар. конф. «Клинические исследования лекарственных средств». — М., 2004.— С. 31–32.

49

2.Гуськова Т.А. Особенности изучения токсичности лекарственных средств различных групп. Препараты для педиатрии. — В кн.: Токсикология лекарственных средств. — Москва, 2008. — С. 56–73.

3.Гуськова Т.А. Токсикологические аспекты одновременного использования различных лекарственных средств. — В кн.: Токсикология лекарственных средств. — Москва, 2003. — С. 116–140.

4.Максимова А.В., Енгалычева Г.Н., Сюбаев Р.Д. Актуальные вопросы экспертизы токсикологических исследований лекарственных средств, предлагаемых для применения в педиатрии. XVII РНК «Человек и лекарство». — М., 2010. — С. 531.

5.Крепкова Л.В., Бортникова В.В., Боровкова М.В., Гнутов В.Б. Токсикологическое изучение беллатаминала на неполовозрелых животных. — XVII РНК «Человек и лекарство» — М., 2010. — С. 649.

6.Маркова И.В. Современные проблемы возрастной фармакологии. Фармакол. и токсикол., 1981. — № 4. — С. 494–499.

7.Directive EMEA/CHMP/SWP/169215/2005/ Guideline on the need for non-clinical testing in juvenile animals of pharmaceuticals for pediatric indications/ London, 24 January 2008.

8.Nonclinical Safety Evaluation of Pediatric Drug Products U.S. Department of Health and Human Services FDA, February 2006.

9.Guideline on the need for non-clinical testing in juvenile animals of pharmaceuticals for pediatric indications, EMEA, January, 2008.

10.Clinical Investigation of Medicinal Products in the Pediatric Population, ICH E11, December 2000.

11.Guidance on nonclinical safety studies for the conduct of human clinical trials and marketing authorization for pharmaceuticals ICH M3(R2) 15 July 2008.