- •Міністерство охорони здоров’я України
- •Ббк 28.072.534я73
- •Передмова
- •Список скорочень
- •1. Загальна характеристика ферментів. Ізоферменти
- •2. Використання ферментів у клінічній практиці
- •3. Класифікація ферментів плазми крові
- •4. Загальна характеристика ферментів, які мають діагностичне значення
- •4.1. Алкогольдегідрогеназа
- •4.2. Альдолази
- •4.3. Альфа-амілаза
- •4.4. Амінотрансферази
- •4.5. Гамма-глутамілтранспептидаза
- •4.6. Глутаматдегідрогеназа
- •4.7. Глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа
- •4.8. Еластаза
- •4.9. Креатинкіназа
- •4.10. Лактатдегідрогеназа
- •4.11. Лейцинамінопептидаза
- •4.12. Ліпаза
- •4.13. 5’-Нуклеотидаза
- •4.14. Сорбітолдегідрогеназа
- •4.15. Трипсин
- •Фосфатази
- •4.17. Холінестераза
- •4.18. Ферменти антиоксидантного захисту
- •5. Типи змін активності ферментів крові при різних патологіях
- •5.1. Зміни активності ферментів при хворобах печінки
- •5.2. Зміни активності ферментів при захворюваннях серця та скелетних м’язів
- •5.3. Зміни активності ферментів при захворюваннях опорно-рухового апарата
- •5.4. Використання ферментів із діагностичною метою в нефрології та урології
- •5.5. Зміни активності ферментів при захворюваннях підшлункової залози
- •5.6. Зміни активності ферментів при захворюваннях травного каналу
- •5.7. Зміни активності ферментів при онкологічних захворюваннях
- •5.8. Використання ферментів із діагностичною метою в пульмонології
- •5.9. Використання ферментів із діагностичною метою в гематології
- •5.10. Використання ферментів із діагностичною метою в неврології та психіатрії
- •5.11. Використання ферментів із діагностичною метою в алергології
- •6. Біохімічні причини спадкових ензимопатій
- •6.1. Ензимопатії обміну вуглеводів
- •4. Непереносимість дисахаридів:
- •6.2. Ензимопатії обміну білків
- •6.3. Ензимопатії обміну нуклеїнових кислот
- •6.4. Ензимопатії гемумісних ферментів
- •6.5. Ензимопатії обміну ліпідів
- •2. Порушення обміну жирних кислот:
- •3. Порушення обміну стеролів:
- •6.6. Ензимопатії обміну порфіринів
- •1. Еритропоетичні порфірії:
- •2. Печінкові порфірії:
- •6.7. Ензимопатії обміну жовчних пігментів
- •7. Деякі аспекти ензимотерапії
- •8. Загальні принципи роботи з ферментами
- •8.1. Ферменти як аналітичні реагенти в клініко-лабораторній діагностиці
- •8.2. Основні принципи визначення активності ферментів у сироватці крові. Одиниці активності ферментів. Недоліки ферментного аналізу
- •Тестові завдання для контролю засвоєння матеріалу
- •100. Клінічними проявами хвороби Мак-Ардля є біль у м’язах, судоми при фізичному навантаженні, міоглобінурія. Активність якого ферменту блокується при цьому захворюванні?
- •101. У дитини підозра на алкаптонурію. Блок якого ферменту відмічається при цьому захворюванні?
- •102. При біохімічному аналізі крові 5-річної дитини виявлено підвищену кількість фенілаланіну. Блокування якого ферменту є причиною цієї уродженої ензимопатії?
- •Ситуаційні завдання
- •Предметний покажчик
- •Додаток а (обов’язковий)
- •При захворюваннях серцевого м’яза
- •В посібнику
- •Активність ферменту в сироватці крові
8. Загальні принципи роботи з ферментами
8.1. Ферменти як аналітичні реагенти в клініко-лабораторній діагностиці
До недавнього часу ферменти були лише об’єктом дослідження в клінічній біохімії, і лише порівняно недавно вони стали використовуватися як аналітичні реагенти, тобто як реактиви для кількісного визначення інших речовин.
Переваги ферментативних методів дослідження: висока точність, специфічність, чутливість. До цього слід додати простоту проведення аналізу, значне скорочення часу дослідження і часто відсутність необхідності побудови калібрувальних графіків.
Використання ферментів як аналітичних реагентів почалося із так званого оптичного тесту Варбурга. Цей тест ґрунтується на тому, що відновлені форми нікотинамідаденіндинуклеотидів (НАДН+Н+ і НАДФН+Н+) мають виражений максимум поглинання в ультрафіолетовій області при 340 нм, тоді як їх окиснені форми (НАД+ і НАДФ+) цього максимуму не мають. Це дозволяє стежити за ходом ферментативної реакції за збільшенням або зменшенням величини оптичної густини при 340 нм, тобто за збільшенням або зменшенням вмісту НАДН+Н+ (або НАДФН+Н+) в аналізованому зразку. Простим прикладом використання оптичного тесту Варбурга є реакція, що каталізується ЛДГ:
піруват + НАДН+Н+ ---> лактат + НАД+
На рис. 3наведена зміна оптичної густини при довжині хвилі 340 нм у ході цієї реакції.
Оскільки в процесі окиснення пірувату кількість НАДН+Н+ знижується, величина оптичної густини також знижується, і це зниження продовжується до того часу, поки весь піруват, що є в пробі, не вступить у реакцію. Цей момент відповідає виходу кривої на графіку на плато. Оскільки піруват і НАДН+Н+ вступають у реакцію в еквімолярних кількостях, то зменшення НАДН+Н+ дорівнює кількості пірувату, що міститься в аналізованому зразку.
Рисунок 3 – Зміна оптичної густини у ході лактатдегідрогеназної реакції
Аналогічним чином може проводитися кількісне визначення всіх речовин, що є субстратами дегідрогеназ (малат, лактат, сукцинат і т. д.).
Розглянута вище ЛДГ-реакція може бути індикаторною при визначенні активності АлАТ. У цій спряженій системі реакції відбуваються за схемою
АлАТ
α-аланін + α-кетоглутарат--------> піруват + α-глутамат,
ЛДГ
піруват + НАДН+Н+---------> лактат + НАД+.
Реакція супроводжується зниженням величини оптичної густини при 340 нм, швидкість якого пропорційна активності АлАТ. Аналогічним чином може бути визначена активність АсАТ, але індикаторним ферментом у цьому випадку буде малатдегідрогеназа.
На використанні глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г6ФДГ) як індикаторного ферменту базується найточніший метод із усіх існуючих методів визначення концентрації глюкози. Тут реакція відбувається за схемою
гексокіназа
глюкоза + АТФ ---------------> глюкозо-6-фосфат + АДФ
Г6ФДГ
глюкозо-6-фосфат + НАДФ+ ----------> 6-фосфоглюконат + + НАДФН+Н+.
Глюкоза за участі гексокінази фосфорилюється до глюкозо-6-фосфату, який за допомогою Г6ФДГ окиснюється до 6-фосфоглюконової кислоти. Ця реакція супроводжується накопиченням НАДФН+Н+ і, отже, зростанням оптичної густини при 340 нм.
Інший підхід до визначення глюкози базується на використанні спряженої системи глюкозооксидаза + + пероксидаза й більш широко відомий. За участі глюкозооксидази глюкоза окиснюється киснем повітря з утворенням перекису водню, кількість якого визначається за його здатністю за наявності пероксидази окиснювати діаміни з утворенням забарвлених продуктів:
глюкозооксидаза
глюкоза + О2 + Н2О -------------> глюконова кислота + Н2О2,
пероксидаза
Н2О2 + барвник ---------------> забарвлений продукт + Н2О.
Як барвники (індикатори) для пероксидазної реакції запропоновано цілу групу речовин: о-толуїдин, о-діанізидин, фенол+4-аміно-антипірин та ін.
Вважають, що реакція з 4-аміно-антипірином має перевагу, оскільки забарвлення, що розвивається, більш стабільне, ніж при використанні інших речовин.
Ця сама пероксидазна реакція за участі 4-аміно-антипірину, запропонована Тріндером, може бути використана для кількісного визначення холестеролу й тригліцеридів.
При визначенні холестеролу його ефіри гідролізуются холестеролестеразою до вільних жирних кислот і холестеролу, який під впливом холестеролоксидази окиснюється киснем повітря до ∆4-холестенону. Перекис водню, що утворюється при цьому, за наявності пероксидази окиснює речовини-індикатори з утворенням забарвлених сполук, інтенсивність забарвлення яких пропорційна вмісту холестеролу в досліджуваному зразку:
холестеролестераза
ефіри холестеролу ------------------> холестерол + R-COOH,
холестеролоксидаза
холестерол + O2 ----------------------> ∆4-холестенон + H2O2,
пероксидаза
2H2O2 + 4-аміно-антипірин + фенол -----> забарвлений продукт + 4H2O2.
Описаний метод визначення холестеролу є найточнішим серед існуючих. У реакції Лібермана-Бурхарда, рутинному методі визначення холестеролу, беруть участь й інші стероли, що призводить до завищених результатів. До інших переваг ферментативного методу необхідно віднести відсутність впливу домішок білірубіну й гемоглобіну, необхідності проводити тривалий гідроліз ефірів і екстракцію холестеролу, відсутність агресивних реагентів.
Ще складніша ферментна система може бути використана для визначення тригліцеридів. Тригліцериди розщеплюються ліпазою до жирних кислот і гліцеролу, який за участі гліцерокінази й АТФ фосфорилюється з утворенням гліцерол-3-фосфату. Гліцерол-3-фосфат за наявності гліцерофосфатоксидази окиснюється киснем повітря з утворенням фосфодіоксіацетону й перекису водню, який, у свою чергу, окиснює барвник із утворенням забарвленого комплексу, інтенсивність забарвлення якого пропорційна концентрації тригліцеридів у досліджуваному зразку.
ліпаза
тригліцерид + 3H2O ---------> гліцерол + 3R-COOH,
гліцерокіназа
гліцерин + АТФ -----------> гліцерол-3фосфат + АДФ,
гліцеролфосфатоксидаза
гліцерол-3фосфат + O2 -------> фосфодіоксіацетон + H2O2,
пероксидаза
H2O2 + 4-аміно-антипірин + 4-хлорфенол -----------> забарвлений комплекс + 2H2O + HCl.
Цей метод визначення тригліцеридів найбільш специфічний, виключно точний і надзвичайно простий у виконанні.
На цей час розроблена ціла група ферментативних методів визначення сечової кислоти. Першим етапом цих методів є розщеплення сечової кислоти уриказою до алантоїну, вуглекислоти й перекису водню:
уриказа
сечова кислота + 2H2O + O2 ------> алантоїн + CO2 + H2O2.
Пероксид водню, що утворився, може бути визначений різними способами:
- за реакцією з 4-аміно-антипірином або іншим аналогічним барвником;
- перетворенням метанолу за участі каталази у формальдегід, який визначається спеціальними методами;
- окисненням перекисом етанолу в ацетатальдегід, який потім відновлюється НАДН (оптичний тест Варбурга).
Слід відзначити високу специфічність усіх ферментативних методів визначення сечової кислоти порівняно з рутинними фосфорно-вольфрамовими методами, оскільки, крім сечової кислоти, фосфорно-вольфрамову кислоту відновлюють аскорбінова кислота, тирозин, триптофан, цистин, цистеїн та ін.
Ще більшу кількість методів запропоновано для ферментативного визначення сечовини. Першим етапом усіх цих методів є розщеплення сечовини уреазою до аміаку та вуглекислоти:
уреаза
сечовина + Н2O ----------> 2NН4+ +CО2.
Визначення іонів амонію може бути здійснене різними способами:
- класичною бертолетовою реакцією;
- модифікованою бертолетовою реакцією із саліцилатом натрію;
- за допомогою оптичного тесту Варбурга.
В останньому випадку індикаторною є реакція
глутаматдегідрогеназа
NН4+ +α-кетоглутарат + НАДН+Н+ --> глутамат + НАД+ +
+ 2Н2О.
Усі ці методи високоспецифічні, оскільки для уреази сечовина є єдиним фізіологічним субстратом, але найточнішим є метод із оптичним тестом Варбурга.
На сьогодні розробляється новий напрям у використанні ферментів: ферментативні методи визначення електролітів (К+, Nа+, Сl+). Ці методи базуються на здатності електролітів виявляти активуючу дію на активність деяких ферментів.