предшественников, содержащих в своей структуре особый сигнальный (лидерный) пептид из 15 – 40 аминокислотных остатков. Именно он обеспечивает перенос белка-предшественника через ЦМ, после чего и отрезается от него с помощью сигнальной (лидерной) пептидазы.

Существует несколько моделей, объясняющих механизм, посредством которого лидерный пептид обеспечивает секрецию белка-предшественника через ЦМ в периплазматическое пространство.

Модель прямого транспорта предполагает прямое вхождение лидерного пептида в липидный бислой мембраны с использованием свободной энергии мембраноассоциированных рибосом.

Сигнальная гипотеза предполагает, что в результате взаимодействия лидерного пептида непосредственно с особым рецептором мембраны образуется внутримембранный канал, через который и осуществляется секреция.

Большой интерес представляет так называемая система секреции 3-го типа (ССТ3). Она осуществляет секрецию эффекторных белков из цитоплазмы клетки через ЦМ и наружную мембрану непосредственно в клетки растения и животного, с которыми бактерия контактирует. ССТ3 обнаружена у бактерий родов Shigella, Salmonella, Yersinia и других и играет у них роль одного из факторов патогенности.

61. Ферменты бактерий. Роль ферментов в патогенности бактерий Идентификация бактерий по ферментативной активности

Ферменты – это высокоспециализированные белки, специфически катализирующие многочисленные химические реакции, происходящие в микробной клетке.

Классификация бактериальных ферментов:

1. По механизму действия:

1)оксидоредуктазы катализируют ОВР (перенос электронов);

2)трансферазы - реакции, идущие с переносом молекул или атомных группировок от одних соединений к другим;

3)лиазы - реакции негидролитического расщепления органических веществ, сопровождаемые отщеплением от них H2O, CO2 и NH3;

4)гидролазы - реакции гидролитического расщепления и синтеза органических веществ, идущие с участием H2O;

5)изомеразы осуществляют внутримолекулярные перемещения радикалов и атомов, превращая органические соединения в их изомеры;

6)лигазы (синтетазы) - реакции синтеза сложных органических соединений из простых.

2. По локализации:

· экзоферменты – выделяются наружу, в окружающую среду; расщепляют сложные органические вещества до более простых молекул в процессе питания, которые способны проходить через ЦПМ;

также определяют инвазивность бактерий – их способность проникать через тканевые барьеры;

·эндоферменты функционируют внутри клетки, осуществляя дальнейшее расщепление питательных веществ, а также участвуют в синтезе структур бактериальной клетки.

3. По субстрату воздействия:

●сахаролитические;

●протеолитические;

●липолитические.

4. По концентрации в окружающей среде:

·конститутивные – ферменты микроорганизов, всегда синтезирующиеся с постоянной скоростью и присутствующие в клетке в постоянных концентрациях (синтез их запрограммирован), например, ферменты гликолитического пути;

·индуцибельные (адаптивные) – ферменты, концентрация которых резко изменяется в зависимости от наличия или отсутствия в среде субстрата;

·репрессибельные – ферменты, синтез которых подавляется в результате избыточного накопления продукта реакции, катализируемой данным ферментом.

Ферменты патогенности – ферменты, субстратами для которых являются вещества, входящие в состав клеток и тканей макроорганизма, способствующие проникновению, распространению и размножению микроорганизмов, т.е. проявлению патогенных свойств (нейраминидаза, гиалуронидаза, коагулаза).

Методы изучения ферментативной активности.

В бактериологической практике для идентификации бактерий определяют сахаролитическую и протеолитическую активность ферментов.

Для определения сахаролитических ферментов используют среды с сахарами:

Для многих м/о таксономическим признаком служит способность разлагать определенные углеводы с образованием кислот и газообразных продуктов. Для выявления этого используют среды Гисса, содержащие различные углеводы (глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу и др.).

Для обнаружения кислот в среду добавляют реактив Андреде, который изменяет свой цвет от бледно-желтого до красного в интервале рН 7,2—6,5, поэтому набор сред Гисса с ростом микроорганизмов называют «пестрым рядом».

Øсреды Гисса (пестрый ряд):

Øжидкие – пептонная вода, индикатор Андреде (кислый фуксин), углеводы, спирты;

Øполужидкие – пептонная вода, 0,5% агар-агар, индикатор бромкрезол, углеводы, спирты;

Øкороткие – содержащие моносахара и дисахара (глюкоза, мальтоза, лактоза, сахароза, маннит);

Øдлинные – короткий ряд + моносахара (арабиноза, ксилоза, рамноза, галактоза и др.), полисахариды (инулин, крахмал и др.), спирты (глицерин, дульцит, инозит и др.).

Øсреда Ресселя – двухсахарный агар (лактоза, глюкоза) и индикатор бромтимоловый синий, Олькеницкого – трехсахарный агар (лактоза, сахароза, глюкоза), индикатор нейтральный красный и соль Мора для выявления H2S.

Под действием сахаролитических ферментов бактерий углеводы и многоатомные спирты расщепляются до кислоты/кислоты и газа. Для обнаружения газа в жидкие среды помещают поплавки, которые при образовании газа всплывают, а в полужидких

–заметно появление пузырьков. Для обнаружения кислоты добавляют индикатор, который под ее действием изменяет цвет.

Øсреды Эндо, Левина, Плоскирева – МПА с лактозой и индикаторами – фуксином, метиленовым синим и нейтральным красным.

У бактерий, ферментирующих лактозу (лактоза+), колонии окрашиваются в цвет индикатора и приобретают металлический блеск, у лактозоотрицательных бактерий колонии остаются бесцветными.

Для определения протеолитических ферментов используют:

Ø определение конечных продуктов распада белков (индол, H2S, аммиак);

М/о засевают в столбик желатина. Через 3—5 дней посевы просматривают и отмечают характер разжижения желатина. При разложении белка некоторыми бактериями могут выделяться специфические продукты — индол, сероводород, аммиак. Для их определения служат специальные индикаторные бумажки, которые помещают в пробирку с МПБ или (и) пептонной водой, засеянными изучаемыми микроорганизмами

Индол (выделяется при разложении триптофана), окрашивает в розовый цвет индикаторную бумажку, пропитанную щавелевой кислотой;

H2S (продукт распада серосодержащих аминокислот – цистеина, метионина), реагируя с ацетатом свинца на индикаторной бумажке, превращается в сульфат свинца и окрашивает бумажку в черный цвет;

Для определения аммиака используют красную лакмусовую бумажку.

О наличии аммиака свидетельствует посинение лакмусовой бумажки.

62. Чистые культуры микроорганизмов. Принципы и методы выделения

Чистая культураэто совокупность микроорганизмов, выделенных на питательной среде, схожие по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, антигенным свойствам.

Методы выделения чистой культуры:

1)Посев по Коху. Принцип: питательный агар вносят в чашку Петри с предварительно разведенным исследуемым материалом, после инкубации колонии растут в толще агара (делается несколько серий разведения). По количеству колоний, степени разведения материала и объему посевной дозы можно определить количество микроорганизмов.

2)Посев истощающим штрихом. Принцип: механическое разделение клеток на плотных средах с помощью бактериальной петли. Петлю прокаливают и наносят штрихи в 4 секции.

3)Посев по Дригальскому. Принцип: посев 0,1 мл. материала на плотную среду и распределяют шпателем шпателем, этим же шпателем делают посев на 2 и 3 чаши.

4)Посев на элективные среды. Принцип: Посев на элективную питательную среду. Элективный фактор подавляет рост одних м/о и создает условия для роста других. Элективным фактором могут послужить антибиотики, химические вещества, бактериофаги.

5)Обработка исследуемого материала кислотой или щелочью. Принцип: обработка бактерий кислотами и щелочами. При этом большинство м/о погибнут и продолжат рост только устойчивые м/о.

6)Прогревание исследуемого материала при 80 градусах. Принцип: при прогревании исследуемого материала погибают все вегетативные формы, остаются только споровые. Эндоспоры устойчивы к действию высоких температур.

7)Фильтрация исследуемого материла через мембранные фильтры. Принцип: жидкий исследуемый материал пропускают через бумажные, асбестовые, синтетические фильтры с порами. М/о будут задерживаться или проходить через фильтр в зависимости от размера. Фильтр с микроорганизмами переносят на чашки с питательной средой Эндо, инкубируют, подсчитывают колонии.

8)Посев по Шукевичу. Принцип: производят посев исследуемого материала в конденсационную воду у основания скошенного агара.Подвижные м/о способны подниматься по скошенному агару, а неподвижные остаются внизу.

9)Заражение лабораторных животных. Основан на неодинаковой чувствительности животных к микроорганизмам.

63. Энергетический метаболизм у бактерий. Типы энергетического метаболизма. Типы дыхания.

Энергетический метаболизм у бактерий:

Метаболизм бактерий - совокупность двух противоположных, но взаимосвязанных процессов — катаболизма, или энергетического метаболизма, и анаболизма, или пластического (конструктивного) метаболизма.

У прокариот, так же как у эукариот, в процессе ферментативных катаболических реакций происходит выделение энергии, которая аккумулируется в молекулах АТФ.

В процессе ферментативных анаболических реакций эта энергия расходуется на синтез многочисленных макромолекул органических соединений, из которых в конечном итоге строятся составные части микробной клетки.

Типы энергетического метаболизма.

Все окислительно-восстановительные реакции энергетического метаболизма у хемотрофных микроорганизмов можно разделить на три типа:

1)аэробное дыхание, или аэробное окисление;

2)анаэробное дыхание;

3)брожение.

Аэробное дыхание – это основной процесс энергетического метаболизма многих прокариот, при котором донором водорода или электронов являются органические (реже неорганические) вещества, а конечным акцептором – молекулярный кислород. Основное количество энергии при аэробном дыхании образуется в электронтранспортной цепи, т. е. в результате окислительного ( мембранного) фосфорилирования. Необходимо помнить, что часто бактерии не до конца (углекислый газ и вода) окисляют органические соединения.

Анаэробное дыхание – цепь анаэробных окислительновосстановительных реакций, которые сводятся к окислению органического или неорганического субстрата с использованием в качестве конечного акцептора электронов не молекулярного кислорода, а других неорганических веществ (нитрата –NO3 - , нитрита – NO2 -, сульфата – SO4 2- , сульфита – SO3 2- , CO2 и др.), а также органических веществ (фумарата и др.). Молекулы АТФ в процессе анаэробного дыхания образуются в основном в электронтранспортной цепи, т. е. в результате реакций мембранного фосфорилирования, но в меньшем количестве, чем при аэробном дыхании.

Брожение– совокупность анаэробных окислительно-восстановительных реакций, при которых органические соединения служат как донорами, так и акцепторами электронов.