1.3 Лабораторная диагностика онихомикоза

При лабораторной диагностике онихомикоза используют основные микологические методы: прямую микроскопию соскобов с ногтевых пластинок, культуральное и реже – гистологическое исследование. Согласно стандарту лечения больных с онихомикозом в России (Приказ №747 от 11.12.2007 г. Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации), для диагностики требуется только микроскопическое исследование. Молекулярно-генетические методы выявления возбудителей онихомикоза находятся на стадии внедрения в рутинную практику микробиологической лаборатории. Чаще всего микроскопию проводят с помощью гидроксида калия (КОН). Для лучшей визуализации элементов грибов, добавляют в патологический материал флюорохром – калькофлюор белый, и препарат просматривают в люминесцентном микроскопе [1]. Однако, микроскопическое исследование позволяет сделать заключение только о грибковой природе инфекции, но не о виде гриба-возбудителя. Кроме того, прямая микроскопия иногда дает ложноположительные и ложноотрицательные результаты.

Проблемы культуральной диагностики связаны, во-первых, с низкой чувствительностью (от 30% до 70%) [65, 137]. Во-вторых, культуральная диагностика онихомикоза длительна по времени (до 1 месяца). Для культурального исследования, как правило, используют посев материала на плотную среду Сабуро. Видовую идентификацию грибов обычно проводят при микроскопическом исследовании выросшей культуры на основании морфологических признаков. В последнее время внедряются молекулярно-

биологические методы видовой идентификации (дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК)-секвенирование и Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI-TOF)-масс-спектрометрия) [109, 110, 180]. Однако, ограниченное число лабораторий выполняют современные диагностические молекулярно- биологические методы, такие как ПЦР и (MALDI-TOF)-масс-спектрометрия. Это приводит к проблемам использования общепринятого диагностического алгоритма [145].

Особые трудности представляет диагностика онихомикоза, обусловленного недерматомицетами, так как плесневые грибы широко распространены в окружающей среде и могут быть выделены при посеве патологического материала ногтевой пластинки в качестве контаминантов. В мировой практике существует несколько подходов к диагностике онихомикоза, обусловленного недерматомицетами.

В 1966 г. Walshe M.M. и English М.Р. предложили критерии диагностики плесневого онихомикоза [177], с последующей модификацией [84]: 1) наличие нитей гриба при прямой микроскопии соскобов с ногтей; 2) отсутствие роста дерматомицета при посеве; 3) рост одного и того же вида недерматомицета в повторных посевах патологического материала (ногтевых пластинок) или в 5 из

20 точек посева.

Gupta et al., в 2000 году предложили альтернативный вариант критериев диагностики: рост культуры одного и того же недерматомицета в 11-ти из 15-ти точек засева фрагментов ногтевой пластинки при положительной прямой микроскопии и отсутствия роста дерматомицета [101].

Shemer A. et al. в 2009 г. описали модифицированный критерий для диагностики онихомикоза, вызванного нитчатыми недерматомицетами. Авторы предложили при выделении культуры плесневого гриба в соскобе с ногтя вновь обследовать больного при повторном визите и взять 3 отдельные пробы материала из пораженного ногтя. Если из всех образцов вырастет тот же вид плесневого гриба – диагноз онихомикоза, обусловленного недерматомицетом, можно считать установленным [129].

В литературе имеются существенные разногласия в использовании критериев диагностики онихомикоза, вызванного недерматомицетами. Обычно применяют 6 главных критериев: 1) положительная прямая микроскопия; 2) выделение культуры; 3) повторное выделение культуры; 4) количество выросших колоний; 5) отсутствие роста дерматомицета; 6) положительный результат гистологического исследования [160].

В настоящее время рекомендуют использовать комбинации из 3 основных применяемых критериев в диагностике онихомикоза, обусловленного недерматомицетами [160].

Гистологическое исследование ногтевых пластинок является высокочувствительным методом диагностики и выявляет онихомикоз в 98% случаев [136]. Однако, этот метод, как и метод микроскопии не позволяет определить видовую принадлежность возбудителя. К тому же это более дорогостоящий, трудоемкий и длительный метод исследования, чем прямая микроскопия биоматериала. Проведение гистологического исследования при диагностике онихомикоза экономически невыгодно, но в некоторых случаях при подозрении на онихомикоз, обусловленный недерматомицетами, может быть единственным методом его доказательства при отсутствии посева [75].

Некоторые авторы предлагают определять кератинолитическую активность недерматомицетов, выделенных из ногтевых пластин, с целью оценки их этиологической роли на модели ex vivo [16].

С внедрением методов молекулярной диагностики в микробиологическую практику стали разрабатываться способы диагностики онихомикоза для точного (даже на уровне вида) и быстрого обнаружения возбудителей в патологическом материале на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР).

В России наиболее доступен способ диагностики онихомикоза с использованием тест-системы «ТрифАм» ООО НПФ «Гентех» (Москва, Россия) [23]. Недостаток способа – выявление в патологическом материале только двух представителей дерматомицетов: Trichophyton rubrum и Trichophyton interdigitale.

Способ диагностики онихомикоза с помощью мультиплексной ПЦР, позволяющий определять родовую принадлежность дерматомицетов (использование универсальных пандерматофитных праймеров) и только один вид Trichophyton rubrum, наиболее частого этиологического агента онихомикоза, в одной реакции, независимо описан в двух работах с применением различных систем праймеров [70, 76] Недостаток этого способа - возможность идентификации только дерматомицетов, и при его применении не решается проблема определения других этиологических агентов онихомикоза, таких как дрожжевые грибы и нитчатые недерматомицеты, а как следствие – его узкая специфичность.

В работе Graser Y. et al., 2012 проведен анализ способов диагностики онихомикоза с помощью тест-систем, представленных на коммерческом рынке. Авторы указывают, что основным недостатком представленных ПЦР тест-систем является узкая специфичность, идентификация только грибов-дерматомицетов.

_[95].

Наиболее полный спектр этиологических агентов онихомикоза позволяет выявлять коммерческая ПЦР тест-система Mentype Mycoderm PCR Amplification Kit (Biotype Diagnostic) [72].

Таким образом, на сегодняшний день, несмотря на возможность обнаружить возбудителей онихомикоза современными молекулярно-генетическими методами, ПЦР-тесты, позволяющие выявлять весь спектр патогенных грибов-возбудителей онихомикоза, отсутствуют.

В случае с нитчатыми микромицетами, определение видовой принадлежности традиционными методами, основанными на морфологических особенностях грибов, затруднено вследствие изменчивости признаков. Из молекулярных методов определения таксономической принадлежности клинически значимых микромицетов наиболее точным в настоящее время считается секвенирование региона Internal transcribed spacer (ITS) [123]. Внутривидовая изменчивость по региону ITS составляет около 2%, однако в ряде случаев разрешающей способности этой геномной последовательности

оказывается недостаточно, поэтому ставится вопрос об идентификации микромицетов по альтернативным маркерам. Среди них — частичная последовательность гена бета-тубулина [132]. Например, амплификация с пангрибковыми праймерами региона ITS, включённого в многокопийный оперон рРНК, с дальнейшим определением последовательности является полезным методом определения видов рода Alternaria. Надёжно определённые последовательности региона ITS, проверенные экспертами, и полезные для сравнения, это: A. alternata AF229461, AF229460 и AF071394, и A. infectoria AF229458, AF229480 и AJ2760558. Кроме того, де Хоог и Хоррэ опубликовали надёжную процедуру дифференциации значимых для медицины представителей рода Alternaria от значимых для медицины представителей рода Ulocladium. Метод основан на ПЦР и использует общие праймеры, с последующей ферментной рестрикцией ампликонов. Однако, два наиболее распространённых клинических вида, A. alternata и A. infectoria, легко различаются по длине ампликона с праймеров ITS1 и ITS4: у первого вида длина домена ITS примерно

570 п.н., а у второго — примерно 600 п.н. [146]. Для дрожжевых грибов альтернативным маркером является D1/D2 регион гена большой рибосомальной ДНК. Молекулярно-генетическая идентификация с помощью ДНК секвенирования проводится согласно рекомендациям Института Клинических и Лабораторных стандартов США (Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)), документ ММ18-А (ISBN 1-56238-664-6).