3 курс / Фармакология / Диссертация_Куркин_Д_В_Противодиабетические_свойства_и_некоторые

161

содержания этого гормона на 119% (p < 0,001). Таким образом, пероральное введение соединения ZB-16 вне зависимости от наличия или отсутствия СД повышает секрецию ГПП-1 в плазме животных.

Начальные концентрации инсулина в крови интактных животных были практически одинаковыми (рис.27Б1, Б2), что свидетельствует о глюкозозависимом характере секреции инсулина в ответ на выработку инкретинов, что особенно важно, поскольку доказывает отсутствие риска развития гипогликемии.

Рисунок 27. Влияние агониста GPR119 ZB-16 на концентрации ГПП-1 (А1, А2), инсулина (Б1, Б2) при пероральном введении интактным и животным с ЭСД при проведении ПТТГ

При измерении концентрации ГПП-1 через 15 минут после пероральной глюкозной нагрузки было обнаружено, что у интактных животных концентрация инкретина увеличилась на 38% (p < 0,01) больше,

чем у животных, получивших плацебо. Аналогичное измерение у животных с экспериментальным СД показало, что у тех, которым давали плацебо,

162

секреция ГПП-1 была меньше, чем у интактных животных, но введение ZB-

16 повышало его концентрацию, и, в итоге, этот показатель отличался от группы плацебо более, чем на 90%. Секреция ГПП-1 на фоне предварительно введенного ZB-16 у животных с экспериментальным СД была выше, чем в интактной группе. Значения концентрации инсулина, зафиксированные у животных с экспериментальным СД до пероральной нагрузки глюкозой, но через 30 минут после перорального введения ZB-16, были больше отмеченных в группе плацебо, на 11%, но значительно ниже, чем у интактных. Измерение концентрации инсулина через 15 минут после внутрижелудочного введения глюкозы показало, что она возрастала в обеих группах, но более выраженно под влиянием ZB-16. Так, концентрация инсулина в группе, животные которой получили ZB-16, через 15 минут после перорального введения глюкозы была на 38% (p < 0,01) выше значений,

зафиксированных в группе, получавшей плацебо. Секреция инсулина,

стимулированная глюкозой, в группах без метаболических нарушений была выше, чем у животных, которым моделировали экспериментальный СД, при этом дополнительное введение ZB-16 приводило к более высокому подъему концентрации инсулина. Разница в концентрации инсулина между животными обеих интактных групп составила 78% (p < 0,01).

Стимулированная секреция инсулина у животных, которым моделировали экспериментальный СД и 28 дней вводили ZB-16, была сопоставима со значениями интактной группы животных, которые получали плацебо.

Секреция инсулина проходит несколько этапов после секреции ГПП-1.

Уровни ГПП-1 достигают максимальной концентрации через 15–20 минут после перорального введения глюкозы.

Секреция инсулина у животных с экспериментальным СД снизилась более выраженно, чем ГПП-1, что, связано не только с уменьшением способности клеток секретировать инкретины, но и с очевидной деструкцией

β-клеток поджелудочной железы. В ходе исследования не было обнаружено значимых различий между уровнями ГПП-1 и инсулина через 15 минут после

163

введения глюкозы между животными с экспериментальным СД, которые получали соединение ZB-16, и интактными. В то же время измерение концентрации глюкозы до и через 15 минут после перорального ее введения показало повышенные значения при обоих измерениях. Начальное значение концентрации глюкозы у животных, терапевтически получавших соединение

ZB-16, было ниже, чем у тех, которым вводили плацебо, но значительно выше, чем у интактных. В то же время при измерении этого показателя через

15 минут после глюкозной нагрузки уровень глюкозы в крови возрастал, но менее значительно, чем в группе, животные которой получали плацебо.

Изначально высокая концентрация глюкозы и отмеченная выраженная под действием перорального введения соединения ZB-16 (сопоставимая с уровнем интактных животных) секреция инсулина может свидетельствовать о том, что введение агониста GPR119, влияет на секрецию инсулина, но не на его синтез. Можно предположить, что это приводит к значительному постпрандиальному увеличению его концентрации, но недостаточность его продукции в отсроченные периоды подтверждается повышенным уровнем глюкозы в крови животных с экспериментальным СД, несмотря на курсовое терапевтическое введение агониста.

В исследовании влияния 28-дневного терапевтического перорального введения агониста GPR119 и его комбинации с метформином животным с экспериментальным СД на концентрацию глюкагона было установлено, что у тех животных, которым вводилось соединение ZB-16 с метформином или без него, концентрация гормона была сопоставимой и минимальной среди животных всех исследуемых групп (рис.28, рис.29).

164

Рисунок 28. Влияние агониста GPR119 ZB-16 на концентрации ГПП-1, инсулина и глюкозы при проведении ПТТГ у животных с ЭСД после 28-ми дней лечения

Примечания: различия достоверны, критерий Ньюмена Кейлса: * - p <0,05, ** - p

<0,01, *** - p <0,001

У животных, которым смоделировали экспериментальный СД и затем в течение 28 дней перорально вводили соединение ZB-16 и его комбинацию с метформином, концентрации глюкагона были минимальными, что, очевидно,

связано со способностью ГПП-1 подавлять его секрецию α-клетками поджелудочной железы. При этом концентрация глюкагона в этих группах была сопоставима между собой, что показывает ведущую роль соединения

ZB-16 на этот показатель. В то же время курсовое терапевтическое введение животным с экспериментальным СД метформина в значительной степени компенсировало нарушения углеводного обмена, что выражалось в более низких концентрациях глюкозы в крови, измеренных натощак, но при этом

165

концентрация глюкагона была выше. Таким образом, при сопоставимых значениях концентрации глюкозы в крови уровень глюкагона между животными, которые получали соединение ZB-16, в том числе и в комбинации с метформином, и только метформин, различались более чем в 2

раза. У животных, которые получали метформин, концентрация глюкагона была меньше, чем у получавших плацебо, и практически не отличалась от значений интактной группы. Соединение ZB-16 более выраженно, чем метформин снижает концентрацию глюкагона, при этом их комбинирование не приводит к увеличению эффекта, что может быть следствием достижения предела эффективности или невозможности дальнейшего снижения концентрации глюкагона в крови экспериментальных животных.

Рисунок 29. Влияние агониста GPR119 ZB-16 и его комбинации с метформином на концентрацию глюкагона и глюкозы у животных с ЭСД после 28 дней лечения

Примечания: различия достоверны критерий Ньюмена Кейлса: * - p < 0,05, ** - p < 0,01, *** - p < 0,001

6.2 Оценка влияния перорального введения соединения ZB-16 на

длительность действия экзогенного инсулина

Учитывая увеличение концентрации инсулина путем стимуляции

секреции ГПП-1 и подавления глюкагона под действием соединения ZB-16,

166

мы предположили, что его пероральное введение может пролонгировать действие инсулина. Одной из задач исследования также была оценка того,

насколько выраженно применение соединения ZB-16 будет пролонгировать действие экзогенного инсулина. Это важно, поскольку можно предположить суммирование гипогликемического действия, вызванного увеличенным количеством эндогенного и экзогенного инсулина. Как отмечалось выше,

секреция инсулина под действием ZB-16 имеет глюкозозависимый характер,

однако изменение концентраций инсулина под действием агониста GPR119

имеет важное клиническое значение. В то же время оценка влияния соединения ZB-16 на действие экзогенного инсулина позволит оценить его действие и в отношении эндогенного.

Рисунок 30. Динамика уровня гликемии (%) при проведении

инсулинового теста толерантности (ИТТ) на интактных (А) и животных

с ЭСД (Б)

Примечание: * – достоверно по отношению к группе Интакт (p <0,05)

После введения инсулина интактным животным в контрольной группе наблюдалось повышение уровня гликемии с 60 по 180 минуту, а в опытной группе на 120 и 180 минутах теста наблюдался значимо меньший уровень гликемии (рис.30А). Таким образом, ZB-16 пролонгирует действие инсулина,

167

что может быть связано или с увеличением его секреции, или чувствительностью тканей к нему.

На животных с экспериментальным СД сахароснижающий эффект тех же доз инсулина (30 минут) выражен меньше, чем у животных без экспериментального СД (рис.30Б). У животных, получавших соединение ZB-

16 в течение 4 недель, эффекты экзогенного инсулина были более выраженными по сравнению с контрольной группой.

Таким образом, при курсовом введении ZB-16 животным с экспериментальным СД отмечается тенденция к потенцированию эффектов экзогенного инсулина, но менее выражено, чем у интактных животных, что может быть связано с меньшей инсулин-секретирующей функцией поджелудочной железы.

6.3 Оценка влияния перорального введения соединения ZB-16 на морфологические изменения в ткани поджелудочной железы крыс с ЭСД§§

На завершающем этапе исследования у животных с изначальным уровнем глюкозы в крови 8–16 ммоль/л (после моделирования экспериментального СД), которые в течение 4 недель перорально получали соединение ZB-16 (0,1 и 1 мг/кг) или плацебо (вода), после эвтаназии с помощью гильотины забирали биологический материал для проведения морфологических исследований. Ткань поджелудочной железы извлекали путем выделения брыжейки двенадцатиперстной и тонкой кишки с последующим разделением на три равных фрагмента – область, прилежащая

кдвенадцатиперстной кишке; желудочная область и селезеночная область.

§§Исследование выполнено совместно с кафедрой патологической анатомии ФГБОУ ВО ВолгГМУ,

за что выражаем искреннюю благодарность зав. кафедрой, д.м.н. А.В. Смирнову и всем сотрудникам

168

При гистологическом исследовании у здоровых животных (интактная группа животных) панкреатические островки были характерной правильной формы с ровными контурами. В различных отделах поджелудочной железы островки существенно отличались в размерах. При проведении иммуногистохимического исследования с использованием антител против инсулина выявлено преобладание инсулин-позитивных β-эндокриноцитов в панкреатических островках во всех отделах железы.

Иммуногистохимическое исследование с использованием антител против белка Ki-67 (маркер пролиферации) и фермента каспаза-3 выявило наличие ядерной экспрессии маркера пролиферации в единичных эндокриноцитах, в

то время как маркер апоптоза в образцах не присутствовал (рис.31, рис.33,

рис.34, рис.35).

У животных с экспериментальным СД отмечалось слабо выраженное полнокровие кровеносных сосудов. Периинсулярная соединительная ткань в ряде случаев была частично инфильтрирована лимфоцитами, отмечался отек.

Панкреатические островки в различных отделах поджелудочной железы имели неправильную форму, неровные контуры, были резко уменьшены в размерах, их количество также было ниже, чем в интактной группе. Средняя площадь и периметр панкреатических островков по сравнению с интактной группой были меньше на 82,9% (p < 0,001) и 60,0% (p < 0,001). При проведении иммуногистохимического исследования ткани поджелудочной железы контрольных животных с использованием антител против инсулина выявлено выраженное уменьшение абсолютной и относительной площади иммунореактивного материала, количества инсулин-позитивных β-

эндокриноцитов в панкреатических островках во всех отделах железы по сравнению с интактной группой. При этом в части островков отмечалось увеличение объемной доли инсулин-негативных эндокриноцитов (Рисунок

32). Морфометрическое исследование показало, что абсолютная и относительная площади инсулин-позитивных эндокриноцитов в панкреатических островках при окрашивании антителами к инсулину по

169

сравнению с интактной группой были меньше на 95,5% (p < 0,001) и 44,2% (p

< 0,001) соответственно.

При проведении иммуногистохимического исследования с использованием антител против белка Ki-67 (маркер пролиферации)

отмечалась меньшая, вплоть до полного отсутствия, экспрессия иммунореактивного материала в эндокриноцитах панкреатических островков животных с ЭСД и не получавших лечения (у интактных животных отмечено наличие ядерной экспрессии иммунореактивного материала в единичных эндокриноцитах панкреатических островков). В то же время при использовании антител против каспаза-3 (Рисунок 36) отмечалось увеличение экспрессии иммунореактивного материала в эндокриноцитах панкреатических островков, которая встречалась в единичных клетках (у

интактных животных отмечено отсутствие цитоплазматической экспрессии иммунореактивного материала в эндокриноцитах панкреатических островков). При морфометрическом исследовании отмечалась тенденция к увеличению абсолютной площади каспаза-3-позитивных эндокриноцитов на

10,2 % (p > 0,05) и значимое увеличение относительной площади каспаза(3)-

позитивных эндокриноцитов в панкреатических островках при окрашивании антителами к инсулину по сравнению с интактной группой на 4,2% (p < 0,001) соответственно, что свидетельствует о возрастании апоптозно-

измененных эндокриноцитов.

170

Рисунок 31. Эндокринная часть (островок) поджелудочной железы интактной крысы с преобладанием инсулин-позитивных β-

эндокриноцитов. ИГХ с АТ против инсулина. Об. Х 40

Рисунок 32. Эндокринная часть (островок) поджелудочной железы контрольной крысы (СД) с резко выраженным снижением инсулин-

позитивных β-эндокриноцитов. ИГХ с АТ против инсулина. Об. Х 40