3 курс / Фармакология / Диссертация_Куркин_Д_В_Противодиабетические_свойства_и_некоторые

71

агонисты GPR119 рассматриваются как перспективные кандидаты на роль лекарственных средств для лечения СД2 и метаболического синдрома.

1.9.2 Агонисты рецептора GPR119

В экспериментальных исследованиях и на здоровых добровольцах установлено, что агонисты GPR119 повышают концентрацию ГПП-1, ГИП и пептида тирозин-тирозин (PYY), снижают гипергликемию после приема пищи или при проведении перорального глюкозотолерантного теста. В

экспериментальных исследованиях установлено кардио-, эндотелио- и

церебропротективное действие, что, в отличие от многих существующих противодиабетических средств, которые обладают только гипогликемическим действием, может сделать их более эффективными в терапии СД и особенно для профилактики его осложнений [Saraiva F. K., 2014; Candeias E. M., 2015].

Агонисты рецептора GPR119 и создаваемые на их основе лекарственные средства могут оказаться эффективными для профилактики и лечения таких состояний, как нарушения углеводного и липидного обмена,

ишемия головного мозга и миокарда [Cox H.M., 2010].

GPR119 может действовать паракринным и/или аутокринным образом,

поскольку активируется множеством различных компонентов пищи,

некоторыми производными поступающих в организм жиров и могут синтезироваться локально в ткани или просвете кишечника [Engelstoft M. S.,

2014]. Аллостерические модуляторы являются более селективными,

поскольку связываются с отличными от занимаемых эндогенными лигандами участками GPR119 [Zhang M., 2013]. Химические структуры, краткая характеристика и результат некоторых клинических исследований наиболее известных агонистов GPR119 приведены в Приложении 2 [Bakir B., 2006].

72

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1Экспериментальные животные

Работы выполнена на линейных крысах (Wistar) и нелинейных мышах обоих полов, которые содержались в стандартных условиях вивария с соблюдением всех правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований на территории РФ. Экспериментальные работы проводились в соответствии с Приказом Минздрава (Минздравсоцразвития) России о надлежащей лабораторной практике, ГОСТом Р 53434-2009

«Принципы надлежащей лабораторной практики, Рекомендациям ВОЗ, «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (1985)». Все исследования были одобрены Региональным независимым этическим комитетом, регистрационный номер: ИРБ 00005839 IORG 0004900 (OHRP) 2 февраля 2014 г. (протокол № 191-2014).

Животные были получены из филиала «Столбовая» ГУ НЦБМТ РАМН (Московская обл.), ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово»» РАМН (Ленинградская область) и содержались с учетом правил Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). Освещение вивария было искусственным, температурный режим постоянным, в диапазоне от +20 до +24°С при влажности воздуха 45–65%.

После доставки из питомника животные осматривались ветеринарным врачом, а затем в течение 14 дней находились на карантинном режиме. По истечении карантина животных перемещали на постоянное содержание в виварий кафедры фармакологии и биофармации ФУВ ВолгГМУ.

73

2.2Исследования in vitro†

Определение медианной эффективной концентрации, EC50, M

Исследование специфической активности осуществляли с использованием линии клеток CHO-K1, в которых был стабильно экспрессирован человеческий рецептор GPR119 (hGPR119). Агонистическая активность соединений ряда ZB оценивалась по возрастанию внутриклеточной концентрации цАМФ, так как известно, что активация рецептора hGPR119 путем последующей активации клеточной аденилатциклазы ведет к повышению внутриклеточного содержания цАМФ.

В качестве экспериментальной платформы была выбрана тест-система Lance

Ultra cAMP (Perkin Elmer).

Определение растворимости

Кинетическую растворимость измеряли с помощью фильтровальной системы Millipore в универсальном буфере в присутствии 2% ДМСО при рН

2, 4 и 7. Контролями с высокой и низкой растворимостью были верапамил и диэтилстильбэстрол соответственно.

Определение микросомальной устойчивости и параметров ингибирования CYP450

Метаболизм соединений изучали в микросомальной фракции печени крыс и человека в присутствии ко-факторов изоферментов цитохрома P450,

отвечающих за I фазу катаболизма ксенобиотиков. Убыль тестируемого вещества в процессе 30 минутной инкубации определяли с помощью ВЭЖХ-

МС/МС анализа. Тест-препараты в концентрации 0,5 мкM инкубировали с микросомальной фракцией печени на шейкере при 37˚C в присутствии НАДФН. Реакции останавливали во временных точках (0, 5, 10, 15, 30 минут)

путем добавления ацетонитрила. После осаждения белков, с помощью масс-

спектрометрии определяли количество оставшегося в супернатантах тест-

† Исследование выполнено совместно с сотрудниками ЦВТ «ХИМРАР»

74

препарата. Инкубацию проводили в биологических повторностях, затем делали по 2 измерения для каждой пробы. Рассчитывали время полураспада

(T1/2), клиренс in vitro (CLint) и оставшееся количество вещества (% от начального).

Тестирование на ингибирование цитохромов 3А4, 1A2, 2C9, 2С19, 2D6

проводили в соответствии с протоколом производителя Invitrogen – Vivid CYP450 screening kit protocol O-13873-r1 US 0405 в 384-луночном формате.

Исследуемые вещества 15 минут предварительно инкубировали с цитохромом в присутствии регенерирующей системы. Затем реакцию инициировали путем добавления в смесь НАДФ+ и специфического субстрата, который после расщепления ферментом способен флуоресцировать. После определенного времени (10–45 мин) добавляли стоп-реагент и измеряли флуоресценцию продукта реакции,

пропорциональную активности цитохрома. Вещества и контрольный ингибитор тестировали в 8 концентрациях, в двух повторах. Максимальная активность фермента – в присутствии 1% ДМСО, без веществ. Минимальный сигнал – при инкубации без фермента. Соединения тестировали в диапазоне концентраций 0,0046–10 мкМ. В качестве контролей использовали известные специфические ингибиторы изоферментов цитохрома Р-450,

рекомендованные в протоколе фирмы Invitrogen.

Определение клеточной токсичности и кардиотоксичности

Исследование клеточной токсичности осуществляли с использованием иммортализованной эпителиальной линии клеток печени HepG2.

Определение кардиотоксичности проводили по оценке влияния субстанции на hERG K+ ионный канал с помощью in vitro тест-системы

Invitrogen® PredictorTM hERG. Метод основан на детекции изменяющейся поляризации флуоресценции, которая уменьшается при вытеснении высокоафинного флуоресцентного лиганда – трейсера тестируемым веществом.

75

Экспериментальные процедуры проводили в соответствии с инструкцией производителя к тест-системе PredictorTM hERG. Суммарный объем реакции составляет 20 мкл, содержание ДМСО – 1%.

2.3Исследуемые соединения и препараты сравнения

В работе визучены соединения, проявляющие агонистический потенциал в отношении GPR119. Соединение-лидер было выявлено в результате целенаправленного скрининга, а также по результатам in vitro и in vivo исследований, включающих проведение оценки агонистического потенциала, растворимости, клеточной токсичности, взаимодействия с изоформами CYP450, выраженностью гипогликемического действия у интактных и животных с экспериментальным сахарным диабетом.

Структурные формулы неактивных или соединений с низкой активностью представлены в Приложении 3 и Приложении 4.

На этапе оценки гипогликемического действия соединения вводились в

дозах от 0,1 до 10 мг/кг, перорально 1 раз в сутки, в виде водной суспензии. В

качестве референтных и/или дополнительных (в случае использования комбинированной терапии) препаратов на различных этапах исследования гипогликемического действия использовали: метформин – 400 мг/кг [Ismail T.A., 2015], ситаглиптин – 5 мг/кг [Vaghasiya J., 2011], при изучении нейропротекторных свойств цитиколин – 500 мг/кг [Парфенов В.А., 2009],

которые вводились по аналогичной схеме и способом (1 раз в сутки перорально в виде водной суспензии), а цитиколин водился внутрибрюшинно 1 раз в сутки после моделирования нарушений мозгового кровообращения. Более подробное описание режима и кратности введения веществ и препаратов сравнения, которые зависели от целей и характера выполняемых исследований, будет представлено в соответствующих главах.

76

2.4Дизайн исследования

Общий дизайн исследования представлен на рисунке 3. В результате комплекса in vitro и in vivo исследований было выявлено соединение лидер под лабораторным шифром ZB-16. На следующем этапе исследования были установлены параметры его острой токсичности, определен терапевтический потенциал. В дальнейшем был проведен комплекс исследований его противодиабетического действия на модели никотинамид-стрептозотоцин-

индуцированного сахарного диабета [Masiello P., 1998; Спасов А.А., 2011].

Влияние перорального введения ZB-16, а также его комбинации с метформином и ситаглиптином на массу тела, потребление животными пищи

иводы, показатели их липидного и углеводного обмена и выраженность эндотелиальной дисфункции оценивались на модели ожирения вызванного содержанием их на высокожировой и углеводной диете. На модели экспериментального СД у животных оценивалось влияние соединения ZB-16

иего комбинаций с метформином и ситаглиптином на концентрацию глюкозы и уровень гликозилированного гемоглобина в крови, скорость утилизации глюкозы при проведении перорального теста толерантности к глюкозе (ПТТГ), концентрацию инсулина и чувствительность к нему,

выраженность нарушений плазменного коагуляционного гемостаза и эндотелиальной дисфункции, а также проводилось изучение морфологических изменений в островковой части ткани поджелудочной железы.

Рисунок 3. Дизайн исследования

78

На следующем этапе исследования были изучены возможные механизмы гипогликемического действия соединения ZB-16, а именно его влияние на секрецию ГПП-1, глюкагона и инсулина, количество β-клеток,

секретирующих инсулин, содержание маркеров апоптоза и пролиферации в них.

Поскольку известны плейотропные (и в основном церебро- и

эндотелиопротективные) эффекты препаратов, пролонгирующих или имитирующих действие эндогенного ГПП-1 (аГПП-1), на завершающем этапе были проведены исследования влияния соединения ZB-16 и его комбинаций с метформином и ситаглиптином на течение острого и хронического нарушения мозгового кровообращения.

Более подробный план исследования будет представлен схематично в начале каждой главы.

2.5Методы экспериментального моделирования СД

Экспериментальный СД моделировался у животных после ночного голодания путем однократного внутрибрюшинного введения никотинамида

(230 мг/кг, Sigma-Aldrich, США) и через 15 минут стрептозотоцина (65 мг/кг,

Sigma-Aldrich, США). Через 3 суток у животных измерялся уровень тощаковой гликемии (после 6 ч голодания) глюкометром Контур ТС (Bayer,

Германия). Кровь забиралась из подъязычной вены. В исследование включались животные с уровнем гликемии в пределах 8–18 ммоль/л, (указанный диапазон будет уточняться для каждого исследования отдельно).

79

Рисунок 4. Схема развития стрептозотоцин-никотинамид-

индуцированного сахарного диабета

На Рисунке 4 также схематично представлен механизм действия стрептозотоцина и никотинамида, совместное введение которых в определенных дозах позволяет добиться частичного поражения β-клеточной массы с развитием состояния умеренной гипергликемии, характеризующейся нарушением секреции инсулина без развития резистентности к нему [Мазо,

В.К., 2016; Спасов А.А., 2011; Masiello P., 1998; Szkudelski T., 2012].

Стрептозотоцин представляет собой цитостатическое средство, ранее применявшееся в терапии инсуломы. Благодаря структурному сходству с молекулой глюкозы стрептозотоцин способен легко проникать в клетки поджелудочной железы путем облегченной диффузии с участием транспортера глюкозы GLUT-2. Цитостатический эффект стрептозотоцина связан с возникающим под его воздействием алкилированием нуклеиновых кислот, что происходит благодаря повышенной генерации активных форм кислорода. Алкилирование ДНК приводит к ошибкам в репарации, которые,

80

накапливаясь, влекут за собой гибель клетки через активацию механизмов апоптоза. Совместное со стрептозотоцином введение никотинамида позволяет снизить активность PARP-1, что снижает активность SOS-

репарации и несколько снижает интенсивность процессов апоптоза, что обеспечивает более мягкое течение экспериментального СД, близкого по картине к СД2, наблюдаемому у человека, но без повышенной секреции инсулина и инсулинрезистентности.

Такая модель СД в значительной степени соответствует определению СД2, которое приводится в национальном руководстве по лечению СД 2017 –

«СД2 типа – это нарушение углеводного обмена, вызванное преимущественной инсулинорезистентностью и относительной инсулиновой недостаточностью или преимущественным нарушением секреции инсулина с инсулинорезистентностью или без нее» [Дедов И. И., 2017].

2.6Метод моделирования ожирения

Моделирование ожирения проводили путем перевода животных

(старых 21-месячных самцов и молодых 12-месячных самок) на содержание в условиях высокожировой и калорийной диеты. Стандартный рацион животных заменялся на сливочное масло (жирность 8,5%; калорийностью

748 ккал/100 г), подсолнечную халву (532 ккал/100 г) и подсолнечный козинак (576 ккал/100 г), питьевую воду заменяли на 10% раствор фруктозы

[Решетняк М.В., 2011]. Самцам соединение ZB-16 и препараты сравнения вводили через 12 недель после начала их содержания на диете. Самкам соединение ZB-16 и его комбинацию с метформином и ситаглиптином начинали вводить сразу после перевода животных на измененный рацион питания.