3 курс / Фармакология / Диссертация_Куркин_Д_В_Противодиабетические_свойства_и_некоторые

191

Рисунок 49. Двигательная (А, Б) и ориентировочно-

исследовательская (В) активность в тесте «Открытое поле» у животных через 72 часа после моделирования ОСМА и лечебного введения исследуемого соединения, метформина и их комбинации

При оценке когнитивной функции у животных с ОСМА и экспериментальным СД с помощью тестов УРПИ и ТЭИ было отмечено значительно меньшее время захода в темный отсек и большее время подныривания (избавления от аверсивной среды), чем у интактных, что свидетельствует об ухудшении сохранения памятного следа и решении задачи экстраполяционного избавления.

192

Рисунок 50. Время захода в темный отсек установки «УРПИ» (А, %

доля животных, не зашедших в отсек) и подныривания в «ТЭИ» (Б, %

доля животных, решивших экстраполяционную задачу) животных через

72 часа после моделирования ОСМА и лечебного введения исследуемого соединения, метформина и их комбинации

В то же время у животных, которым после операции продолжили вводить соединение ZB-16 и метформин, показатели когнитивной функции оказались значительно лучше, чем у животных негативного контроля, а у животных, получавших цитиколин, эти показатели были сопоставимы с группой контроля (рис.50). Комбинирование ZB-16 с цитиколином,

193

метформином и одновременно с цитиколином и метформином не влияло на церебропротективное действие агониста GPR119.

Таким образом, терапевтическое введение церебропротекторного средства цитиколин животным, у которых ОСМА была смоделирована на фоне 4-недельного СД, не приводило к значимому ограничению (регистрация на 24 час после операции) или снижению (через 48 часов после операции)

тяжести психоневрологического дефицита. В то же время в группах животные, которые с начала эксперимента получали соединение ZB-16,

метформин или их комбинацию, а затем после моделирования ОСМА и цитиколин, показатели психоневрологического дефицита практически не отличались от таковых, в которых церебропротекторный препарат заменяли физиологическим раствором. Очевидно, это связано с тем, что на фоне СД развивается ряд нарушений в функционировании нервной и сердечно-

сосудистой системах, тяжесть которых зависит от величины и длительности гипергликемии и наличие которых в значительной степени усугубили последствия ОСМА и снизили эффективность цитиколина.

Экспериментальные группы, животные которых получали гипогликемическую терапию, легче переносили 30-минутную ОСМА, и

регресс психоневрологического дефицита через 48 часов после операции у них был более заметен. В настоящем исследовании также было обнаружено,

что метформин сопоставимо с соединением ZB-16 компенсировал нарушения углеводного обмена, однако после моделирования ОСМА психоневрологическое состояние этих животных было хуже и через 24, и

через 48 часов наблюдения. В то же время введение после ОСМА цитиколина животным, которые на протяжении всего эксперимента получали метформин, привело к тому, что их показатели были несколько лучше, чем аналогичная группа без церебропротектора, но хуже, чем у животных,

которые получали только ZB-16 (без цитиколина).

Мозговой кровоток (МК), регистрируемый игольчатым датчиком лазерного допплерографа в проекции средней мозговой артерии, у животных,

194

перенесших ОСМА, был ниже, чем ЛО (группа СД+ЛО+NaCl).

Минимальные значения МК регистрировались в группах животных с СД и ОСМА и в течение 3 дней получавших физиологический раствор или цитиколин. У животных, которым после моделирования ОСМА перорально вводили соединение ZB-16, метформин или их комбинацию, значения МК были достоверно выше, чем в группе, получавшей физиологический раствор.

При этом добавление к терапии церебропротекторного препарата цитиколин не приводило к значимому повышению МК (рис.51А).

Рисунок 51. Мозговой кровоток (А), число десквамированных эндотелиоцитов (Б) и изменение мозгового кровотока в ответ на введение модификаторов синтеза оксида азота (В) через 72 часа после моделирования ОСМА и лечебного введения исследуемого соединения,

метформина, цитиколина и их комбинации

Количество десквамированных эндотелиальных клеток является

общепризнанным маркером повреждения эндотелия [Wu H., 2007]. Анализ

195

артериальной крови показал, что большее их количество было у животных с экспериментальным СД, которые не получали, предшествующей ОСМА,

гипогликемической терапии (СД+ЛО+NaCl, СД+ОСМА+NaCl,

СД+ОСМА+Цит). Напротив, у животных, которым вводили соединение ZB-

16, метформин и их комбинацию, с цитиколином или без, нарушения углеводного обмена были выражены меньше, число десквамированных эндотелиоцитов также было достоверно меньше (рис.51Б).

При оценке функциональной активности эндотелия, а именно стимулированной (ацетилхолином) и базальной (при введении L-NAME)

секреции NO, было отмечено, что менее выраженные сосудистые реакции наблюдались у животных, которым в течение 3 дней вводили физиологический раствор или цитиколин. В группе ЛО животных отмечались максимально выраженные сосудистые реакции в ответ на стимулирование и блокаду eNOS, что обеспечивает более высокий мозговой кровоток и свидетельствует о меньшей выраженности эндотелиальной дисфункции. Сосудистые реакции животных, которые получали соединение

ZB-16, его комбинации с метформином и/или цитиколином, были более выражены, чем в контрольной группе, и превосходили отмеченные в группах, получавших метформин и его комбинацию с цитиколином

(рис.51В).

В настоящее время установлено, что важную роль в развитии эндотелиальной дисфункции при СД отводят развитию оксидативного стресса [Аметов А.С., 2016; Касаткина С.Г., 2011; Потемкин В.В., 2015]. Так при гипергликемии такие процессы как аутоокисление глюкозы, перекисное окисление липидов, активация индуцибельной NO-синтазы способствуют избыточному образованию свободных радикалов – молекул, обычно содержащих атом кислорода с непарным электроном и обладающих высокой реагентной способностью [Ghosh, S., 2015; Pitocco D., 2010]. Посольку при СД активность собственных антиоксидантных систем снижена, что совместно с избытком образования свободных радикалов, ведет к развитию

196

оксидативного стресса [El-Sahar A.E., 2015; Wiernsperger N.F., 2003; Kitasato L., 2012; Xu J., 2009]. В дополнение к этому отмечается снижение выработки

NO – базового фактора антиатерогенеза, который противостоит формированию атеросклеротической бляшки на всех этапах. Доказано, что оксидативный стресс ведет к нарушению нормального функционирования эндотелия, что вызывает уменьшение выработки NO, увеличение выработки адгезивных молекул, вазоконстрикторов и других факторов, которые затем приводят к воспалению, тромбозу, поражению сосудистой стенки [Pitocco D., 2010; Булаева Н.И., 2013]. Супероксид-ион реагирует с NO, при этом образуется пероксинитрит (ONOO), который не является вазодилататором,

но цитотоксичен и усиливает повреждающее действие продуктов свободно-

радикального окисления. К тому же NO полагают, является одной из биохимических субстанций, которая при повышении концентрации глюкозы в крови вызывает высвобождение инсулина и увеличение потребления глюкозы тканями [Слиецанс А.А., 2010; El-Remessy A.B., 2010]. Поэтому мы посчитали целесообразным оценить содержание продуктов перекисного окисления, а именно реагирующих с ТБК, концентрация которых отражает интенсивность процессов ПОЛ, повышение которой отмечается при гипергликемии. Так, их концентрация была выше у животных, которым моделировали СД без последующей ОСМА (группа СД+ЛО+NaCl) или с ней

(группа СД+ОСМА+NaCl, СД+ОСМА+Цит) и которые не получали гипогликемическую терапию. Фокальная ишемия головного мозга, очевидно еще в большей степени, усилила оксидативный стресс, поскольку концентрация ТБК-активных продуктов у животных этих групп

(СД+ОСМА+NaCl, СД+ОСМА+Цит) была максимальной. В тех группах,

которые получали соединение ZB-16, его комбинацию с метформином или цитиколином, но не метформин в отдельности, концентрация ТБК-активных продуктов была достоверно ниже, чем в контрольной группе, что свидетельствует о меньшей интенсивности ПОЛ и соответственно о меньшем проявлении оксидативного стресса (рис.52).

197

Рисунок 52. Концентрация продуктов, прореагировавших с ТБК

(А) и продолжительность кислотного гемолиза эритроцитов (Б) у

животных после моделирования ОСМА и лечебного введения исследуемого соединения, метформина, цитиколина и их комбинации

Косвенным показателем длительности и интенсивности оксидативного стресса является поврежденность клеточных мембран, оценить которую возможно при анализе ее устойчивости к действию агрессивных внешних факторов [Рабаданова А.И., 2013]. В настоящем исследовании мы оценивали скорость разрушения мембран эритроцитов при помещении их в кислую среду. Чем быстрее протекал гемолиз, тем более поврежденной была мембрана эритроцита и тем тяжелее был оксидативный стресс, вызванный СД и последующей ОСМА. Наиболее выраженные изменения были отмечены у животных, перенесших ОСМА на фоне СД, гемолиз эритроцитов у них происходил в максимально короткие сроки, тогда как у животных,

198

получавших ZB-16 или его комбинацию с цитиколином и/или метформином,

устойчивость эритроцитов повышалась, о чем свидетельствовал более продолжительный период гемолиза, что также косвенно указывает на менее выраженный оксидативный стресс у этих животных (рис.52Б).

При СД и развитии эндотелиальной дисфункции наблюдаются изменения в системе гемостаза, сдвиг потенциала на тромбогенный,

прокоагулянтный. В системе гемостаза принимают участие факторы свертывающей, противосвертывающей (антикоагулянтной) и

фибринолитической систем крови. Изменение функционального состояния одной из систем сопровождается компенсаторными сдвигами в деятельности другой [Грицай Н. Н., 2006; Северина А.С., 2004; Хасанова Ю.В., 2013]. В

связи с чем на следующем этапе было изучено действие агониста GPR119 и

его комбинации с метформином и цитиколином на основные показатели плазменного гемостаза животных на фоне СД и ОСМА.

У экспериментальных животных с воспроизведенной на фоне СД и ОСМА отмечались выраженные нарушения плазменного гемостаза. Так, у

животных негативной контрольной группы и тех, которым вводили цитиколин, и группы ЛО животных (с СД, но без ишемии) было отмечено укорочение длительности АЧТВ, ПВ и ТВ, а также более высокая концентрация фибриногена. В то же время у получавших соединение ZB-16,

метформин (менее выраженно) и их комбинацию, указанные выше показатели плазменного гемостаза достоверно отличались от таковых в группах, не получавших предшествующей ОСМА гипогликемической терапии (рис.53).

199

Рисунок 53. Влияние лечебного введения исследуемого соединения,

метформина, цитиколина и их комбинации на длительность АЧТВ (А),

ПВ (Б), ТВ (В) и концентрация фибриногена (Г) у животных с СД и после моделирования ОСМА

Повышение коагулопатического потенциала является одной из основных причин развития первой и повторной цереброваскулярной катастрофы, а также фактором, в значительной степени осложняющим реабилитацию пациента. Сахарный диабет значительно отягощает течение экспериментальной фокальной ишемии головного мозга [Бакулин Д.А.,

2016], увеличивая гибель экспериментальных животных по сравнению с моделированием аналогичной патологии у интактных животных сопоставимого пола, веса и возраста. Причиной, отягощающей течение ОСМА на фоне СД, может быть образование большего, чем у интактных животных тромба, вызывающего ОСМА, а соответственно изначально большей ядерной зоны некроза и более быстрого ее распространения. В

настоящем исследовании показано, что у животных, которые не получали предшествующей ОСМА гипогликемической терапии, тяжесть эндотелиальной дисфункции, выраженность оксидативного стресса,

200

повреждение клеточных мембран и нарушения плазменного гемостаза были более выраженными, что, очевидно, является причиной сравнительно более тяжелого течения ОСМА и большей зоны некроза мозговой ткани (рис.54).

Рисунок 54. Влияние лечебного введения исследуемого соединения,

метформина, цитиколина и их комбинации на размер зоны некроза мозговой ткани у животных через 72 часа после моделирования ОСМА

Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что меньшие, чем в группе ЛО животных, значения скорости мозгового кровотока после 30-минутной ОСМА могут быть частично объяснены более интенсивным протеканием процессов постреперфузионного тромбообразования, о чем косвенно свидетельствуют отмеченные нарушения плазменного гемостаза и большие размеры зоны некроза мозговой ткани.

Сниженная реакция эндотелия на активацию eNOS ацетилхолином свидетельствует о низкой стимулированной секреции оксида азота, как основного вазодилатирующего фактора, а меньший вазоконстрикторный эффект L-NAME – о сниженной его базальной продукции. Оксидативный стресс и низкая устойчивость клеточных мембран к кислотному гемолизу также, очевидно, являются, с одной стороны, маркерами эндотелиальной