- •(Экспериментальное исследование)
- •Список сокращений и аббревиатур, использованных в работе
- •Глава 1. Перспективы применения ксеногенной ткани селезенки для коррекции постспленэктомических нарушений (обзор литературы) 10
- •Глава 2. Материалы и методы исследования 25
- •Глава 3. Получение криоконсервированных клеток селезенки свиньи для ксенотрансплантации 41
- •Глава 4. Морфофункциональная оценка эффективности ксенотрансплантации клеток селезенки как способа коррекции индуцированного гипоспленизма 55
- •Глава 5. Изменения гомеостаза в условиях постсплен-эктомического гипоспленизма, корригированного ксенотрансплантацией клеток селезенки 79
- •Введение
- •Глава 1. Перспективы применения ксеногенной ткани селезенки для коррекции постспленэктомических нарушений (обзор литературы)
- •Проблема постспленэктомического гипоспленизма
- •1.1.1. Клинико-лабораторные проявления синдрома постспленэктомического гипоспленизма
- •1.1.2. Способы профилактики и коррекции гипоспленических послеоперационных расстройств
- •Ксенотрансплантация свиных органов и тканей
- •1.3. Технология получения материала для ксенотрансплантации
- •Глава 2. Материалы и методы исследования
- •2.1 Общая характеристика экспериментального материала
- •2.2. Характеристика методов исследования
- •2.2.1. Техника оперативных вмешательств
- •2.2.1.1. Ложная операция
- •2.2.1.2. Спленэктомия
- •2.2.1.3. Экстраперитонеальная аутотрансплантация селезенки
- •2.2.1.4. Ксенотрансплантация клеток селезенки
- •2.2.2.Приготовление препаратов для ксенотрансплантации
- •2.2.2.1. Получение взвеси клеток селезенки
- •2.2.2.2. Приготовление питательной среды для инъекции
- •2.2.2.3 Ранотензиометрия
- •2.2.3. Методы лабораторного контроля
- •2.2.3.1.Определение биохимических показателей сыворотки крови
- •2.2.3.3. Исследование показателей системы гемостаза
- •2.2.3.4 Иммунологические методы исследований
- •2.2.3.5 Общеклиническое исследование крови
- •2.2.3.6 Бактериологические методы исследований
- •2.2.4. Методы морфологического исследования
- •2.3.Методы статистической обработки
- •Глава 3. Получение криоконсервированных клеток селезенки свиньи для ксенотрансплантации
- •3.1.Технология выделения клеток селезенки
- •3.1.1 Дезагрегация ткани селезенки
- •3.1.2. Оптимизация рН среды для культивации клеток
- •3.1.3 Культивирование клеток селезенки новорожденной свиньи
- •3.2.Консервация клеток
- •3.2.1. Приготовление среды для криоконсервации
- •3.3. Получение препарата и ксенотрансплантация
- •Глава 4. Морфофункциональная оценка эффективности ксенотрансплантации клеток селезенки как способа коррекции индуцированного гипоспленизма
- •4.1 Развитие постспленэктомического гипоспленизма в ходе эксперимента
- •4.2 Летальность в экспериментальных группах
- •4.2.1. Патоморфологическое исследование погибших животных
- •4.3. Морфологическая оценка эффектов трансплантации ткани селезенки в условиях гипоспленизма
- •4.3.1 Исследование структуры печени
- •4.3.2.Исследование структуры легких
- •4.4. Морфологическое исследование зон трансплантации
- •4.5. Результаты ранотензиометрических исследований
- •Глава 5. Изменения гомеостаза в условиях постсплен-эктомического гипоспленизма, корригированного ксенотрансплантацией клеток селезенки
- •5.1. Лабораторная оценка раннего гепатопротекторного эффекта ксенотрансплантации культуры клеток селезенки
- •5.2. Влияние ксенотрансплантации клеток селезенки на белково-синтетическую функцию печени в раннем послеоперационном периоде
- •5.3. Изменения неспецифической резистентности организма у аспленизизированных животных под воздействием ксенотрансплантации клеток селезенки в раннем послеоперационном периоде
- •5.4. Влияние ксенотрансплантации клеток селезенки на систему гемостаза в раннем периоде после индукции гипоспленизма
- •Заключение
- •Практические рекомендации
- •Список использованной литературы
2.2.3.3. Исследование показателей системы гемостаза
Оценку гемокоагуляционного статуса у экспериментальных животных выполняли в лаборатории гемостаза НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН (зав. - канд. биол. наук В.И. Марченко). Нормальные показатели определены у 6 здоровых крыс-самцов использованной линии.
Гематокритное число определяли с помощью микроцентифуги [17]. Агрегацию тромбоцитов исследовали экспресс-методом визуальной оценки по А.С. Шитиковой (1984) [19]. Нормальный показатель (средняя величина) был принят за 100%. Агрегацию тромбоцитов у крыс экспериментальных групп выражали в процентах к норме. Концентрацию фибриногена (г/л) определяли с помощью микрометода [31]. Для исследования брали венозную кровь в пробирке с 3,8% цитрата натрия в соотношении 9:1. Вязкость крови на бумаге (ед.) исследовали по методу А.Ф. Пирогова, В.Д. Джорджия (1988) [121].
Определение времени свертывания крови (с) проводили по методике Lee, White [19]. Протромбиновый индекс (%) вычисляли после определения протромбинового времени по Квику [19].
Все показатели исследованы у 6 крыс каждой экспериментальной группы на 7, 14 и 21сутки эксперимента, за исключением КГ-2, в которой выполнение лабораторных исследований проводили только на 7 сутки эксперимента.
2.2.3.4 Иммунологические методы исследований
Иммунологические исследования проводили в иммунологической лаборатории Центральной научно-исследовательской лаборатории Иркутского государственного института усовершенствования врачей (зав. - канд. мед. наук А.В. Кочкин). Для определение параметров фагоцитарной реакции нейтрофилов крови использовали убитые при температуре 80-900С клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Оценивали фагоцитарный показатель (фагоцитарная активность или фагоцитарный индекс) - процент фагоцитов из числа сосчитанных нейтрофилов, и фагоцитарное число - среднее число дрожжей, поглощенных одним активным нейтрофилом [58,93]. Для оценки степени антигенной раздраженности неактивированных in vitro гранулоцитов крови исследовали спонтанный тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест), выражая результаты в процентах. Активированный НСТ-тест (%) определяли для оценки функционального резерва кислородзависимого механизма бактерицидности фагоцитов [58,93].
2.2.3.5 Общеклиническое исследование крови
Общий анализ крови выполняли в иммунологической лаборатории Центральной научно-исследовательской лаборатории Иркутского государственного института усовершенствования врачей. Подсчитывали количество эритроцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу крови по общепринятым методикам [93].
2.2.3.6 Бактериологические методы исследований
Бактериологические исследования выполнены в группе бактериологии НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН совместно с н.с. Е.В. Коваль. У всех погибших крыс исследовали ткань легкого и экссудат из плевральной полости для выявления возбудителя. Посев проводили на стандартные питательные среды по методу Gould в модификации Рябинского- Родомана [87].
2.2.4. Методы морфологического исследования
Обзорная световая микроскопия, контроль жизнеспособности клеток для трансплантации были выполнены в лаборатории патоморфологии (зав.- канд. мед. наук О.А. Гольдберг). Обзорная световая микроскопия и цитологические исследования выполнены совместно с О.А. Гольдбергом.
Для обзорной световой микроскопии материал фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина. На светооптическом уровне исследовали депарафинированные срезы, окрашенные гематоксилином и эозином, гематоксилином и пикрофуксином [89].
Препараты исследовали в фотомикроскопе III (К. Цейсс, Германия). Для определения клеточного состава ткани печени выведенных из эксперимента животных на 7, 14 и 21 сутки эксперимента проводили количественную оценку методом счетного квадрата по Автандилову с использованием окуляр – микрометра [2]. С помощью окулярной морфометрической сетки подсчитывали количество паренхиматозных клеток и непаренхиматозных клеточных элементов, также учитывали лимфоцитарную инфильтрацию портальных трактов в 5 полях зрения (площадь каждого поля зрения составляла 25600 мкм2) на препаратах печени 6 крыс каждой группы. Препараты исследовали с использованием иммерсионного объектива при конечном увеличении х1200.
Воспалительный процесс в легких, выраженность пневмонии оценивали по трехбалльной системе: 1 балл - при вовлечении в процесс до1/3 паренхимы; 2 балла - при вовлечении 1/3-2/3 паренхимы; 3 балла - при вовлечении больше 2/3 паренхимы..