- •(Экспериментальное исследование)
- •Список сокращений и аббревиатур, использованных в работе
- •Глава 1. Перспективы применения ксеногенной ткани селезенки для коррекции постспленэктомических нарушений (обзор литературы) 10
- •Глава 2. Материалы и методы исследования 25
- •Глава 3. Получение криоконсервированных клеток селезенки свиньи для ксенотрансплантации 41
- •Глава 4. Морфофункциональная оценка эффективности ксенотрансплантации клеток селезенки как способа коррекции индуцированного гипоспленизма 55
- •Глава 5. Изменения гомеостаза в условиях постсплен-эктомического гипоспленизма, корригированного ксенотрансплантацией клеток селезенки 79
- •Введение
- •Глава 1. Перспективы применения ксеногенной ткани селезенки для коррекции постспленэктомических нарушений (обзор литературы)
- •Проблема постспленэктомического гипоспленизма
- •1.1.1. Клинико-лабораторные проявления синдрома постспленэктомического гипоспленизма
- •1.1.2. Способы профилактики и коррекции гипоспленических послеоперационных расстройств
- •Ксенотрансплантация свиных органов и тканей
- •1.3. Технология получения материала для ксенотрансплантации
- •Глава 2. Материалы и методы исследования
- •2.1 Общая характеристика экспериментального материала
- •2.2. Характеристика методов исследования
- •2.2.1. Техника оперативных вмешательств
- •2.2.1.1. Ложная операция
- •2.2.1.2. Спленэктомия
- •2.2.1.3. Экстраперитонеальная аутотрансплантация селезенки
- •2.2.1.4. Ксенотрансплантация клеток селезенки
- •2.2.2.Приготовление препаратов для ксенотрансплантации
- •2.2.2.1. Получение взвеси клеток селезенки
- •2.2.2.2. Приготовление питательной среды для инъекции
- •2.2.2.3 Ранотензиометрия
- •2.2.3. Методы лабораторного контроля
- •2.2.3.1.Определение биохимических показателей сыворотки крови
- •2.2.3.3. Исследование показателей системы гемостаза
- •2.2.3.4 Иммунологические методы исследований
- •2.2.3.5 Общеклиническое исследование крови
- •2.2.3.6 Бактериологические методы исследований
- •2.2.4. Методы морфологического исследования
- •2.3.Методы статистической обработки
- •Глава 3. Получение криоконсервированных клеток селезенки свиньи для ксенотрансплантации
- •3.1.Технология выделения клеток селезенки
- •3.1.1 Дезагрегация ткани селезенки
- •3.1.2. Оптимизация рН среды для культивации клеток
- •3.1.3 Культивирование клеток селезенки новорожденной свиньи
- •3.2.Консервация клеток
- •3.2.1. Приготовление среды для криоконсервации
- •3.3. Получение препарата и ксенотрансплантация
- •Глава 4. Морфофункциональная оценка эффективности ксенотрансплантации клеток селезенки как способа коррекции индуцированного гипоспленизма
- •4.1 Развитие постспленэктомического гипоспленизма в ходе эксперимента
- •4.2 Летальность в экспериментальных группах
- •4.2.1. Патоморфологическое исследование погибших животных
- •4.3. Морфологическая оценка эффектов трансплантации ткани селезенки в условиях гипоспленизма
- •4.3.1 Исследование структуры печени
- •4.3.2.Исследование структуры легких
- •4.4. Морфологическое исследование зон трансплантации
- •4.5. Результаты ранотензиометрических исследований
- •Глава 5. Изменения гомеостаза в условиях постсплен-эктомического гипоспленизма, корригированного ксенотрансплантацией клеток селезенки
- •5.1. Лабораторная оценка раннего гепатопротекторного эффекта ксенотрансплантации культуры клеток селезенки
- •5.2. Влияние ксенотрансплантации клеток селезенки на белково-синтетическую функцию печени в раннем послеоперационном периоде
- •5.3. Изменения неспецифической резистентности организма у аспленизизированных животных под воздействием ксенотрансплантации клеток селезенки в раннем послеоперационном периоде
- •5.4. Влияние ксенотрансплантации клеток селезенки на систему гемостаза в раннем периоде после индукции гипоспленизма
- •Заключение
- •Практические рекомендации
- •Список использованной литературы
4.3. Морфологическая оценка эффектов трансплантации ткани селезенки в условиях гипоспленизма
Морфологию печени и легких оценивали на 7, 14 и 21 сутки эксперимента, выводя в каждой группе по 6 животных на срок исследования.
4.3.1 Исследование структуры печени
При микроскопическом исследовании печени на 7 сутки у животных всех экспериментальных групп, кроме КГ-3, отмечали следующую картину: центролобулярные, дольковые и балочные структуры сохранены, однако, присуствуют гепатоциты с нарушенной структурой и некротические процессы с лейкоцитарной инфильтрацией. Наиболее выраженные изменения были обнаружены на светооптическом уровне в зоне портальных трактов.
Так как морфологическая картина структуры печени у экспериментальных животных ОГ-1, ОГ-2, КГ-1 и КГ-2 не различалась, морфометрия с подсчетом гепатоцитов и непаренхиматозных клеточных элементов на 7-е сутки не проводилась.
В КГ-3 структура печени не изменена. Центролобулярные, дольковые и балочные структуры сохранены. Структура гепатоцитов сохранена, признаков их повреждения нет.
В ОГ-1 на 14-е сутки отсутствовали очаги некрозов гепатоцитов и лейкоцитарной инфильтрации, в отличие от картины печени у погибших крыс. Структура гепатоцитов, балочная и дольковая структуры печени сохранены, признаков их повреждения нет. Инфильтрация портальных трактов лимфоцитами незначительна. К 21-м суткам эксперимента при обзорной световой микроскопии картина оставалась прежней, отмечалось увеличение количества гепатоцитов по сравнению с другими экспериментальными группами
В ОГ-2 и КГ-1 на 14-е сутки наблюдали сохранение балочной и дольковой структур печени, встречали очаги гидропической дистрофии гепатоцитов. Присутствовала инфильтрация портальных трактов лимфоцитами. На 21-е сутки структура гепатоцитов и их ядер сохранена, балочные и дольковые структуры не нарушены, отмечается инфильтрация лимфоцитами портальных трактов более выраженная, чем в ОГ-1 и КГ-3. В ОГ-2 выявлено увеличение количества фагоцитирующих эритроциты Купферовских клеток по сравнению с ОГ-1 и КГ-1.
В КГ-3 на светооптическом уровне структура печени не изменена. Структура гепатоцитов сохранена, признаков их повреждения нет. Центролобулярные, дольковые и балочные структуры печени сохранены – рис. 4.4.
Рис.4.4. Структура печени на 21 сутки эксперимента. А - КГ-3 (ложная операция), Б - ОГ-1 (ксенотрансплантация ККС), В – ОГ-2 (ксенотрансплантация выделенных КС), Г – КГ-1 (экстраперитонеальная АТС). 1 - печеночная балка, 2 - портальный тракт с лимфоцитарной инфильтрацией. Окраска гематоксилином и эозином. Об. 40х, Ок. 10х.
Данные морфометрии печени с подсчетом гепатоцитов и непаренхиматозных клеточных элементов во всех экспериментальных группах представлены в табл. 4.3. При статистической обработке результатов морфометрического исследования оказалось, что на 14-е сутки количество гепатоцитов в ОГ-1 не отличается от нормы (животные с ЛО, КГ-3), в то же время в ОГ-2 количество гепатоцитов существенно выше нормы (pU=0,002), а также существенно выше, чем в других группах с трансплантацией ткани селезенки (pU = 0,02-0,004). В КГ-1 количество гепатоцитов существенно ниже нормы (pU=0,006). К 21 суткам количество гепатоцитов в ОГ-1 существенно (pW=0,004) увеличивалось по сравнению с 14 сутками и их количество было достоверно больше, чем во всех других группах. (pU=0,004). В ОГ-2 количество гепатоцитов существенно снижалось к 21 суткам (pW=0,004) и было существенно ниже нормы (pU=0,006). В КГ-1 также увеличивалось количество гепатоцитов (pW=0,01) по сравнению с 14 сутками, но на 21 сутки их количество не отличалось от нормы.
Таблица 4.3
Морфометрия печени на 14 и 21 сутки эксперимента (медиана, нижний и верхний квартили)
Клеточные элементы |
Сутки |
Экспериментальные группы |
|||
ОГ-1 |
ОГ-2 |
КГ-1 |
КГ-3 |
||
Гепатоциты |
14 |
38,0 ** (36,6-39,0) · |
42,6 (40,4-45,6) · |
34,1** (33,8-35,3) · |
38,7** ¨ (38,2-40,0) |
21 |
55,0 **¨¨ (52,2-58,0) |
32,6 ¨¨ (31,6-35,4) |
40,5 * (39,4-41,8) |
38,8 (38,2-40,0) |
|
Клетки Купфера с эритрофагоцитозом |
14 |
3,5 ** (3,4-3,8) · |
3,9 (3,6-4,2) |
3,5 ** (3,4-3,6) · |
3,5 (3,4-3,6) |
21 |
2,0 ** (1,8-2,4) |
4,5 ¨¨ (3,4-5,8) |
2,8 ** (2,6-3,2) |
3,5 ¨ (3,2-3,6) |
|
Эндотелиоциты и клетки Купфера |
14 |
11,1 **¨¨ (10,8-12,8) |
9,7 ¨¨ (9,2-10,4) |
11,7 ** (11,4-11,8) |
7,0¨ (6,6-7,2) |
21 |
12,5 ¨¨ (11,4-14,4) |
9,9 ¨¨ (9,6-10,5) |
10,5 (9,0-12,0) |
7,0 ¨ (6,6-7,4) |
|
Сумма непаренхиматозных клеток печени |
14 |
21,2**¨¨ (20,6-22,0) · |
20,5 (19,0-23,0) |
22,8 * (22,4-23,2) |
19,8¨¨ (18,8-20,4) |
21 |
27,4 ¨¨ (26,9-30,6) |
26,1 ¨¨ (22,6-27,6) |
26,9 (22,4-29,4) |
19,8 ¨ (18,6-21,2) |
|
Инфильтрация портальных трактов |
14 |
0,4 ** (0,4-0,6) |
0,8 ¨¨ (0,6-0,8) |
0,8 * (0,6-1,0) |
0,4 ¨ (0,2-0,6) |
21 |
1,0 ** ¨¨ (1,0-2,0) · |
4,0 ¨¨ (4,0-5,0) · |
4,5 * (4,0-5,0) · |
0,4 ¨ (0,2-0,6) |
Примечания: * - значимые различия по критерию Манна –Уитни по сравнению с показателем в ОГ-1 (pU£0,05); ** - по сравнению с ОГ-2; ¨ - по сравнению с КГ-1; ¨¨- по сравнению с КГ-3; · - значимые различия по критерию Вилкоксона по сравнению с показателем в группе на 21 сутки (pW£0,05).
Количество фагоцитирующих эритроциты клеток Купфера при сравнительном морфометрическом анализе ни в одной группе не имело значимых отличий на 14-е сутки по сравнению с ложной операцией. К 21 суткам количество наблюдений эритрофагоцитоза в клетках Купфера существенно снижалось в ОГ-1 и КГ-1 (pU=0,006 и 0,02 соответственно) и было статистически значимо ниже, чем в норме (pU=0,005 и 0,02 соответственно). В ОГ-2, напротив, отмечено некоторое (статистически незначимое) повышение числа клеток Купфера, фагоцитирующих эритроциты, по сравнению с предыдущим показателем и с нормой.
Количество эндотелиоцитов и нефагоцитирующих КК было существенно выше нормы в ОГ-1, ОГ-2 и КГ-1 (pU=0,02-0,004) на 14-е сутки. Ни в одной группе их количество их количество достоверно не изменилось к 21 суткам; этот показатель был существенно выше нормы в ОГ-1 (pU=0,005).
На 14-е сутки суммарное количество непаренхиматозных клеток печени, рассчитанное при морфометрии, было существенно выше в ОГ-1 по сравнению с нормой и КГ-1 (pU=0,003 и 0,004). В ОГ-2 статистически значимых различий с нормой не было. К 21 суткам этот показатель еще более повышался в ОГ-1, оставаясь существенно выше нормы (pU=0,03) и не отличался от ОГ-2 и КГ-1, в которых сумма непаренхиматозных клеток также превосходила нормальные значения (pU=0,01).
Лимфоцитарная инфильтрация портальных трактов у ложно-оперированных и в ОГ-1 встречалась не во всех наблюдениях и составила (медиана) 0,4 на 14-е сутки исследования. У животных КГ-2 и КГ-1 этот показатель был существенно выше по сравнению с ОГ-1 и КГ-3 (pU=0,03 и 0,05). К 21 суткам количество лимфоцитов, инфильтрирующих портальные тракты существенно увеличивалось у животных всех групп, кроме КГ-3 (pW=0,003-0,004) и было достоверно выше, чем у ложнооперированных (pU=0,003-0,004). При этом в ОГ-1 инфильтрация портальных трактов оказалась существенно более низкой, по сравнению с ОГ-2 (pU=0,005) и КГ-1 (pU=0,003).
Таким образом, в ОГ-1 к 21 суткам зарегистрировано существенное увеличение количества гепатоцитов, по сравнению с 14 сутками и с другими группами, а также увеличение общего количества непаренхиматозных клеток на 21-е сутки по сравнению с нормой и (статистически незначимое) с другими экспериментальными группами при минимальной среди них лимфоцитарной инфильтрации портальных трактов.