5. Основные методы исследования морфологии бактерий. Методы микроскопии. Методы окраски микробов и их отдельных структур. (методы Грама, ЦиляНильсена, Бурри-Гинса и др.).

Микроскопия - изучение объектов с использованием микроскопа.

Задачи микроскопии: выявление микроорганизмов в различных материалах; ориентировочная идентификация микроорганизмов в исследуемом образце; изучение некоторых морфологических признаков и структур; изучение окрашенных мазков из колоний и чистых культур.

Основные методы:

• светлопольная микроскопия-позволяет исследовать объекты в проходящем свете в светлом поле. Она предназанчена для исследования морфологии, взаимного расположения, структурной организации клеток и других особенностей. Макс. разрешающая способность до 0,20 мкм. Для увеличения разрешения применяют иммерсионную систему

• фазово-контрастная микроскопия-применение микроскопов с устройством, переводящим фазовые изменения световых волн, проходящие через объект, в амплитудные. При этом возможно наблюдать живые объекты с коэф. преломления близким к коэф. преломления среды (прозрачные объекты становятся контрастными и видимыми в поле зрения). Изучают форму, размеры, подвижность, размножение и др.

• темнопольная микроскопия-освещение объекта косыми лучами света (эффект Тиндаля), при этом лучи не попадают в объектив. Если в образце есть микроорганизмы, то косые лучи отражаются от их поверхности, изменяют направление и попадают в объектив. Такое освещение достигается использованием специального конденсора. но видны только контуры клеток

• люминесцентная микроскопия-основана на способности ряда веществ светиться под действием падающего на него света. М/о содержащие хлорофилл, витамин В12,алкалоиды и др. обладают первичной люминесценцией. Клетки с отсутствующей люминесценцией обрабатывают спец красителями- флуохромами в виде сильноразбавленных растворов. На ее основе разработаны иммунофлюоресцентные методы (специфическое взаимод антигена изучаемого объекта и меченых флюоресцентными красителями антигенов)

• электронная микроскопия-изучает объекты меньшие, чем длина световой волны (0,5-1,0 нм).Этим методом можно подробно изучить детали бактериальных структур.Существует 2 вида электронных микроскопов:

1. Трансмиссионный - пучок электронов, пройдя через образец, формирует изображение на экране или пластинке.

2. Сканирующий – пучок электронов быстро сканирует поверхность образца, вызывая излучение, которое формирующее изображение на светящемся экране.

Окраску мазка производят просты­ми или сложными методами. Простые за­ключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю — Нильсену и др.) включают последо­вательное использование нескольких красителей. Отношение микроорганиз­мов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений.

• При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, ис­пользуя красители анилинового ряда (основные или кис­лые). Если красящий ион (хромофор) — катион, то краситель обладает основными свойствами(генциановый фиолетовый, метиленовый синий), если хромо­фор - анион, то краситель имеет кислые свойства ( кислый фуксин, эозин). Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином - 2 мин, метиленовым синим — 5—7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе.

• Сложные методы окраски применяют для изуче­ния структуры клетки и дифференциации микроорганиз­мов. Окрашенные мазки микроскопируют в иммерсион­ной системе. Последовательно нанести на препа­рат определенные красители, одни из которых – основыне, а другие-дополнительные. Кроме этого используют и обесцвечивающие вещества (спирт, кислоты, ацетон и др.)

Существуют несколько основных окрасок:,

По Цилю-Нильсону: кислотоустойчивые бактерии – красный, некислотоустойчивые - синий)

по Бурри-Гинсу - обнаружение капсул

по Нейссеру - зерна волютина

по Ожешко - споры

6. Морфология, ультраструктура, химический состав бактерий. Основные отличия прокариотов от эукариотов. Субклеточные формы бактерий: протопласты, сферопласты, L- формы. Их значение в медицинской практике

Бактерии являются прокариотами. Они имеют: клеточную стенку, цитоплазматическую мембрану, цитоплазму, рибосомы, мезосомы и ядерную субстанцию (нуклеоид) из ДНК.

Морфологические типы бактерий:

• кокки (сферические)-одиночные(микрококки), парные (диплококки), тетракокки, сарцины, цепочками (стрептококки), образующие скопления в виде грозди винограда (стафилококки), до 1-2 мкм

• палочковидные бактерии – самые многочисленные, до 5-10 мкм, одиночные и в виде цепочек

• извитые бактерии – бывают 3 типов: вибрионы (изогнуты в виде запятой-холерны вибрион), спириллы (несколько крупных завитков-возбудитель возвратного тифа), и спирохеты (тонкие и спиралевидные с множеством завитков и петель-возбудитель сифилиса)

• нитчатые бактерии- цепочки из цилиндрических, овальных или дисковидных клеток

• мицелийобразующие – относят истинные актиномицеты, имеющие сильно разветвленный мицелий

• бактерии, образующие выросты – почкующиеся и стебельковые бактерии (выросты- выпячивание клеточного содержимого, служат для крепления к субстрату, друг к другу и для размножения)

• микоплазмы не имеющие клеточной стенки

Клеточная стенка – покрывающий всю пов-ть прокариотической клетки. Основа-пептидогликан, обеспечивающий ригидность и эластичность. Пептидогликан состоит из чередующихся остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, с каждым остатком ковалентно связан тетрапептид

• У ГРАМ «+»: немного белков, липидов, полисахаридов; основной компонент – многослойный до 40 слоев пептидогликан (муреин), состовл-й до 90% массы клетки; с петидогликаном ковалентно связаны тейхоевые кислоты

• У ГРАМ «-»:пептидогликан однослоен и покрыт наружней мембраной мозаичного строения и связан с ней липопротеином; внутренний слой наружней мембраны – фосфолипиды, а в наружнем слое – липополисахариды( состоят из 3 фрагментов- липида А-одинакового у всех ГРАМ «-», стержневой части и О-специфической цепи полисахарида); науржная мембрана пронизанами белками-поринами, между наружней и внутренней мемрабной располагается периплазматическое пространство (содержит ферменты и коспоненты транспортной ситемы).

Бактериальная клетка может иметь и необязательные компоненты:

• капсула-бывает микрокапсула(видна только на электронном микроскопе в виде микрофибрилл) и макрокапсула(слизистый слой покрывающий снаружи клеточную стенку);функции – защитная, адгезивная. Для обнаружения применяют специалльные методы окраски (Метод по Бури-Гинсу)

• споры-как форма сохранения наследственной информации при неблагоприятных условиях. Образуются в присутствии О2 и t не ниже -15С и не выше +43С, очень устойчивы, погибают при кипячении 2-6 часов и стерилизации в автоклаве. Для обнаружения применяют как простые, так и сложные методы окраски (по Ожешко).

• жгутики-тонкие нити начинающиеся от ЦПМ и имеющие длину больше клетки; состоит из спиралевидной нити, крюка и базального тельца; жгутики состоят из спиралезакрученного белка-флагеллина. Монотрихи-1 жгутик (холерный вибрион), перитрихии –до неск-х десятков и сотен (кишечная палочка), лофотрихи-пучок жгутиков на одном из полюсов, амфитрихи-жгутики на обоих полюсах.

• пили-нитевидные образования тоньше жгутиков, отходящие от пов-и клетки и состоящие из белка пиллина. Пили различны: ответственные за адгезию, питание, водно-солевой обмен, половые пили.

В сравнении с эукариотами, прокариоты:

• имеет меньшие размеры

• отсутствует ядерная мембрана, гистоны, аппарат Гольджи, митохондрии, хлоропласты

• гаплоидный набор хромосом

• бинарный способ размножения

• чаще встречается анаэробный тип дыхания

Под действием антибиотиков-ингибитор синтеза пептидогликанов (пенициллина), лизоцима, защитных факторов организма на растущую бактериальную клетку возможно образование безоболоченных форм бактерий с нарушенной клеточной стенкой из-за отсутствия петидогликана:

• протопласты-полностью лишены КС

• сферопласты-частично лишены КС

В изотонической среде прото- и сферопласты подвергаются плазмолизу, а в гипертонической сохраняют слабую метаболическую активность, но не способны при этом к размножению.

• L-формы-бактерии полностью или частично утратившие КС, но способные к размножению. Могут возникать в естественных условиях в орг-е человека при длительном лечении пенициллином. Способны к поддержанию хронического инфекционного процесса. L-формы различают стабильные – не способные к реверсии (восстановление в исходный вид и способности к синтезу пептидогликана) и нестабильные – способные к реверсии